07月03 【成功案例】通過(guò)轉錄組研究合浦珠母貝異種異體移植大珠母貝的免疫抑制反應

Transcriptome analysis of the immune reaction of the pearl oyster Pinctada fucata to ?xenograft from Pinctada maxima

1. 1. 研究背景

   大珠母貝（P. maxima）通過(guò)同種異體移植的方法進(jìn)行培養面臨很大的困難，而對于合浦珠母貝（P. fucata）而言，同種異體移植培養較容易實(shí)現。如果合浦珠母貝可以作為孕育受體去培養大珠母貝珍珠，將有益于大珍珠培養產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。移植后的免疫抑制反應是阻礙該產(chǎn)業(yè)前行的一大障礙。據前期的研究統計，珠母貝通過(guò)異種異體移植的存活率約在6.3%-15.4%之間。人體器官異種異體移植的免疫反應已有相關(guān)報道；在軟體動(dòng)物中，異種異體移植的免疫抑制反應也有報道；但是在珠母貝免疫反應研究中，僅有一項通過(guò)轉錄組技術(shù)對珠母貝同種異體移植免疫抑制反應的研究。

   2. 研究目的

   此項研究希望通過(guò)轉錄組技術(shù)對合浦珠母貝異種異體移植后免疫分子變化進(jìn)行探索，尋找對抗宿主珠母貝免疫抑制反應的策略。

   3. 材料方法

   ?3.1實(shí)驗材料

   大珠母貝，合浦珠母貝

   實(shí)驗組：

   同種組：合浦珠母貝植入合浦珠母貝地幔片

   異種組：合浦珠母貝植入大珠母貝地幔片

   對照組：合浦珠母貝

   實(shí)驗組分別取手術(shù)后不同時(shí)期的宿主珠母貝（0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h和?96 h）血淋巴，?Control組收集宿主珠母貝的血淋巴（0h），共15個(gè)樣本，分別進(jìn)行RNA提取。

   ?3.2測序方法和數據量

   測序平臺：Illumina Hiseq?2500 platform

   總計得到107.93Gb的clean reads，平均每個(gè)樣本7.1Gb的數據。

   3.3分析方法

   所有分析在百邁客云平臺完成（BMK Cloud?：http://www.holisticcircumcision.com/）。

   主要分析：

   a．數據質(zhì)控 （去接頭，去低質(zhì)量的序列）；

   b．利用合浦珠母貝參考基因組進(jìn)行組裝；

   c．與數據庫比對（NR、Swiss-Prot 、GO 、COG 、KOG 、Pfam 和KEGG）注釋?zhuān)?/p>

   d．差異表達基因分析（GO分析、KEGG通路富集）。

   4.技術(shù)路線(xiàn)

5.實(shí)驗結果

5.1轉錄組測序結果

分別對14個(gè)實(shí)驗組和1個(gè)對照組樣本進(jìn)行轉錄組測序，測序數值如表1所示，每個(gè)樣本的Q30都在91.42%以上，GC含量在42.19%和45.38之間。

5.2?差異表達基因分類(lèi)和功能注釋

分別將各個(gè)時(shí)期（0h、6h、12h、24h、48h、72h、和96h）同種異體移植組（M組）和異種異體移植組（B組）基因表達量進(jìn)行比對，獲得各個(gè)時(shí)期的差異表達基因，在0h，獲得的差異表達基因最多，共2265個(gè)，其中1097個(gè)上調，1168個(gè)下調（FDR﹤0.05，log2 ratio ≥1）。

圖1.不同時(shí)期差異表達基因

將每個(gè)時(shí)期的差異表達基因進(jìn)行GO分類(lèi)，獲得45-49個(gè)子分類(lèi)，根據GO的三大功能類(lèi)別(cellular component,molecular function和biological process)分析，大多數免疫相關(guān)的基因被富集到biological process這一類(lèi)。

通過(guò)KEGG通路富集分析，各個(gè)時(shí)期的差異表達基因分別富集到148（M0/BO），106（M6/B6），99（M12/B12），92（M24/B24），73（M48/B48），123（M72/B72），和96（M96/B96）個(gè)通路中。

5.3異種異體移植引起的免疫相關(guān)差異表達基因

為了鑒定這些差異表達基因參與的免疫路徑，探索異種異體移植引起的基因表達具體變化，研究人員通過(guò)GO富集將各時(shí)期的同種移植和異種移植免疫反應相關(guān)差異表達基因分成不同的功能類(lèi)別（P≤0.05），在M0/B0組中，細胞循環(huán)，NADH脫氫酶活性等相關(guān)基因顯著(zhù)富集，其中一些與免疫學(xué)過(guò)程相關(guān)；在M12/B12組中，有大量的氧化還原過(guò)程和調控細胞轉移的unigenes，它們可能參與血球細胞的轉移和吞噬；通過(guò)數據分析得到，48h和72h中，損傷修復是重要的term，它與免疫反應最相關(guān)；在96h，細胞凋亡是重要的term。

結合KEGG通路富集分析，在M0/B0的比對中發(fā)現，核糖體，氧化磷酸化和GPI錨等相關(guān)路徑被顯著(zhù)富集。在M6/B6比對中，有9個(gè)顯著(zhù)富集的通路，包括細胞凋亡、拼接體和MAPK信號通路等，且大多數通路與免疫功能相關(guān)；值得注意的是MAPK信號通路在6h、24h、72h和96h組多次出現并且顯著(zhù)富集。MAPK信號通路和其他免疫相關(guān)通路富集，可能是該研究中描述同種異體移植和異種異體移植免疫反應差異的一個(gè)好起點(diǎn)。

圖2.不同時(shí)期差異表達基因GO富集圖

通過(guò)unigene聚類(lèi)分析鑒定了不同時(shí)間點(diǎn)的免疫相關(guān)基因：在0h，參與氧化還原反應的基因（包括NADH脫氫酶1、細胞色素c氧化酶1等）在異種異體移植中上調；在6h，熱休克蛋白70、熱休克70kDa蛋白等在異種異體移植中比同種異種中表達量高；在12h，NADH脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在異種移植中高表達；

研究人員通過(guò)GOterm分析檢測到參與氧化還原反應的表達基因，在24h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植中大量表達；在48h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和熱休克蛋白70在異種異體移植中大量表達；在72h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植組中表現出下調；96h，熱休克蛋白70和TNF受體關(guān)聯(lián)因子6繼續在異種異體移植中高表達，表明免疫反應依然存在。

圖3.不同時(shí)期unigene聚類(lèi)熱圖

5.4移植引起的差異表達基因鑒定

將兩個(gè)實(shí)驗組分別與對照組進(jìn)行比對后，再將比對后的同種異體移植與異種異體移植進(jìn)行比對。獲得不同時(shí)期（ 0h/6h/12h/24h/48/72h/96h）的差異表達基因分別為518，814，807，710，689，700，832個(gè)。

圖4.兩實(shí)驗組與對照組比對韋恩圖

通過(guò)KEGG通路富集分析，河馬信號通路、內質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、 MAPK信號通路、核糖體等通路顯著(zhù)富集。許多基因在實(shí)驗組高表達，在對照組表達量較低，細胞異常死亡蛋白1和蛋白激酶7在對照組中表達量較高，但是在實(shí)驗組中幾乎不表達，說(shuō)明這些差異表達基因是由移植引起 。

6.RT-PCR驗證

從不同表達水平中隨機選擇10個(gè)與免疫相關(guān)差異表達基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗，實(shí)驗結果與RNA-Seq結果基本一致，證明了本實(shí)驗中的差異基因表達譜準確可靠。

圖5.RT-PCR驗證

7.結論

綜上所述，無(wú)論在同種移植還是異種移植，免疫抑制都是重要的免疫反應。細胞凋亡、河馬信號通路、氧化還原作用、MAPK信號通路、核糖體、內質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、嘌呤新陳代謝、NF-kappa B 信號通路、氧化磷酸化、Ras 信號通路、泛素介導的蛋白質(zhì)水解參與了移植應答反應。NADH脫氫酶、HSP70、細胞凋亡蛋白酶-7分別在氧化還原反應，MAPK信號通路和細胞凋亡途徑表現出不同的表達量?？梢酝茰y氧化還原反應很可能是移植后免疫抑制反應中的關(guān)鍵因素。這些發(fā)現有助于闡明異種異體移植免疫抑制反應的分子機制，也有益于珠母貝異種移植免疫抑制試劑的開(kāi)發(fā)。

8.創(chuàng )新點(diǎn)

通過(guò)珍珠貝同種移植和異種移植差異表達基因的比較研究，尋找異種異體移植免疫抑制中的關(guān)鍵影響因素，開(kāi)辟了珍珠貝異種異體移植研究的新方向。

 

立即體驗