07月03 “逆向思維”——良性病變組織NGS研究高分文章解析

習慣了正向思維不如來(lái)個(gè)反向思維；

???????????????????????????????????惡性癌組織研究多了不如研究下良性病變組織

文獻：Ye L, Zhou X, Huang F, et al. The genetic landscape of benign thyroid nodules revealed by whole exome and transcriptome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8.

?研究背景：

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）：是最常見(jiàn)的甲狀腺癌，其發(fā)病率約占甲狀腺癌發(fā)病率的70-80%， 每10萬(wàn)人中有5.7個(gè)人患有PTC，女性約為8.8人，男性約為2.7人，屬于低度惡性腫瘤，分化程度高，預后良好。甲狀腺癌發(fā)病的第一癥狀是在頸部的甲狀腺區出現結節，結節常為無(wú)痛性，甲狀腺結節發(fā)生率很高，這些結節中約有5%的結節可能會(huì )出現癌變。已經(jīng)有諸如TCGA等研究機構對PTC的腫瘤相關(guān)變異進(jìn)行了鑒定（BRAF和RAS基因突變等），但是對于良性結節的基因組特征所知甚少。良性增生性甲狀腺結節，尤其是腺瘤樣結節，尚未研究過(guò)。

新穎點(diǎn)/研究目的：1.甲狀腺癌組織研究的很多，良性結節的遺傳和表達景觀(guān)如何？

• 傳統認為PTC和良性結節具有獨立起源，是否可以提供基因組層面證據？
• 傳統的基因檢測技術(shù)通過(guò)檢測惡性癌組織相關(guān)突變標志提供納入標準（rule-in）輔助診斷，是否可以鑒定良性組織相關(guān)突變標志提供排除標準（rule-out）？

實(shí)驗材料：共計28例患者的經(jīng)過(guò)手術(shù)獲得的127個(gè)樣本的癌組織（PTC）或結節組織、正常組織及配對的germline外周血液樣本?；颊吒鶕袩o(wú)PTC癌組織分成2組，TB和SB（只有良性結節，且持續2年）。

研究結果：

1.良性腺瘤樣甲狀腺結節相比于乳頭狀甲狀腺癌具有獨特的變異

外顯子組測序（平均161X）結果顯示，相比于外周血，在正常組織、良性結節組織和乳頭狀甲狀腺癌組織中共計檢測到了528個(gè)基因中的688個(gè)體細胞突變，腫瘤組織和結節組織中體細胞突變數目（/Mb）明顯高于正常組織，但腫瘤組織和結節組織的突變特征（6種類(lèi)型的堿基替換及其上下文）卻明顯不同。

經(jīng)過(guò)高頻突變基因（significantly mutated genes,SMGs）分析，乳頭狀甲狀腺癌中以BRAF突變?yōu)橹鳎?0%樣本中攜帶），最主要的是BRAFV600E突變，這與TCGA的研究是一致的。而良性結節（TB和SB兩組）組織中與癌組織中完全不同，檢測到了互相排斥的ZNF148 (21.4%)、SPOP (14.3%) 和EZH1 (10.7%)。

 

高頻突變基因頻譜

 

在額外的231例良性結節中對上述三個(gè)基因中主要的體細胞突變進(jìn)行了驗證，ZNF148基因突變頻率有所下降（5.4%），其他2個(gè)基因突變保持相似水平（SPOP P94R 11.2%，EZH1 Q571R 9.3%）。55例濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinomas，FTC）中未檢測到上述3個(gè)基因突變，表明特異存在于良性結節中。

SPOP，EZH1和ZNF148體細胞突變示意圖

利用人正常甲狀腺細胞系Nthy，構建突變體進(jìn)行功能實(shí)驗發(fā)現，EZH1 Q571R突變細胞系相比于野生型細胞系，細胞增殖能力輕微增加，侵襲能力降低。EZH1體細胞突變可能是甲狀腺腫的早期刺激因素之一。

細胞增殖和侵襲實(shí)驗

對外顯子數據進(jìn)行CNV分析，只在癌組織中檢測到了已知的PTC相關(guān)的22號染色體長(cháng)臂arm水平拷貝數缺失，而良性結節中沒(méi)有發(fā)現重現性的CNV。轉錄組數據分析后，也沒(méi)有發(fā)現重現性或者功能性的基因融合。

TB組來(lái)自相同PTC患者配對的癌組織和良性結節間相同的突變很少

PTC癌組織-良性結節pairs間的共有突變頻率展示

PTC癌組織和良性結節的重疊突變頻率最低（0-21.4％，中位數7.7％）。 當考慮匹配的正常組織時(shí)，只有9個(gè)PTC癌組織和良性結節對顯示重疊的突變（1.7-7.4％）。共有突變少與純度沒(méi)有顯著(zhù)相關(guān)性。TB組20個(gè)PTC患者的配對組織間體細胞突變變異等位基因頻率（variant allele frequency,VAF）進(jìn)行相關(guān)性分析，癌組織-良性結節間的相關(guān)性最差。

配對樣本間體細胞突變VAF相關(guān)性熱圖

良性結節與PTC癌組織間具有不同的基因表達模式

對9個(gè)患者（5個(gè)TB和4個(gè)SB）的26個(gè)組織進(jìn)行轉錄組測序，相比于正常甲狀腺組織共計檢測到21441個(gè)差異表達基因，只有8％的上調和3.1％的下調基因在PTC和良性結節之間重疊。

差異表達基因Venn圖

經(jīng)過(guò)層次聚類(lèi)分析，惡性癌組織聚類(lèi)在一起，和良性結節/正常組織分開(kāi)，且TB和SB的良性結節組織聚類(lèi)在一起，表明二者間相似的功能。

差異表達基因層次聚類(lèi)熱圖

采用3種已知的甲狀腺分化和信號傳導特征分類(lèi)器均發(fā)現良性結節和PTC癌組織明顯分離。3個(gè)分類(lèi)器分別為：甲狀腺分化評分（TDS，16個(gè)與甲狀腺代謝和功能相關(guān)的基因）、ERK活性評分（EAS，用于MEK / ERK活性測定的52個(gè)基因）和BRAF-RAS突變特征相關(guān)的71個(gè)基因集。

甲狀腺分化評分TDS和ERK活性評分熱圖

良性結節和PTC癌組織獨立進(jìn)化

對20名患者構建了系統發(fā)育樹(shù)，以說(shuō)明PTCs、良性結節和正常甲狀腺組織之間的進(jìn)化關(guān)系。大多數患者（15/20例）在良性結節和PTC之間早期即處于不同分支進(jìn)化，特別是在正常甲狀腺組織納入分析時(shí)，表明PTC癌組織與良性結節間早期分離和不同的進(jìn)化模式。

基于突變的系統發(fā)育樹(shù)

研究結論

本研究提供強有力的證據表明良性甲狀腺結節具有與PTC癌組織不同的遺傳和轉錄組景觀(guān)，證實(shí)了良性結節發(fā)育與PTC腫瘤形成不同。 良性甲狀腺結節不同于癌前病變，例如存在復發(fā)性BRAF突變的黑素細胞痣或具有惡性轉化風(fēng)險的良性病變。作者認為，將SPOP，ZNF148和EZH1作為良性結節相關(guān)基因的納入，通過(guò)提供“排除”信息，有可能提高基于DNA的突變檢測的診斷效能。在目前的甲狀腺分子診斷中添加良性相關(guān)突變標志，從而提供“排除”信息，可能會(huì )增加其診斷功效。

 

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