07月19 【成功案例】雞中腹部前脂肪細胞分化過(guò)程中lncRNA和mRNA表達的全基因組分析

Genome-Wide Analysis of lncRNA and mRNA Expression During Differentiation of Abdominal Preadipocytes in the Chicken

PMID:?28108554

雜志：G3 (Bethesda)

影響因子：2.861

 

研究背景：腹部脂肪是肉雞的重要胴體性狀。選育過(guò)程中對雞快速生長(cháng)率的過(guò)分強調導致了過(guò)多的脂肪堆積，過(guò)量的脂肪沉積導致飼料轉化率、胴體產(chǎn)量、產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率降低。因此，腹部脂肪含量較低成為肉雞的主要育種目標。脂肪細胞生成是受多種轉錄事件調節的一個(gè)復雜過(guò)程，近期的一些研究通過(guò)全基因組范圍內的mRNA?(Ji et al.?2012；Regassa and Kim 2015)和microRNA?(Wang et al.?2015)分析，探索了雞脂肪生成的相關(guān)調節機制。但是目前對脂肪生成的調節機制知之甚少。此外，長(cháng)鏈非編碼RNA（lncRNA）調節脂肪形成和其他與代謝組織發(fā)育和功能相關(guān)的過(guò)程，但是雞體內前脂肪細胞分化期間lncRNAs的功能和特征尚不清楚。

材料方法：

1.實(shí)驗材料：

取14日齡京海黃雞，無(wú)菌條件下分離4g腹部脂肪組織。剪碎組織、膠原酶I消化并分離基質(zhì)血管組分后，利用DMEM/F12培養基（含10%胎牛血清），在35℃和5% CO₂的條件下培養至90%匯合度。分別誘導分化0、48、96和144 小時(shí)后取樣進(jìn)行RNA-seq，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做三個(gè)生物學(xué)重復。

2.測序方法及數據量：

RNA-seq，Illumina XTen.?從12個(gè)樣本總共獲得了1,300,074,528 clean reads?(195.02 Gb)。

技術(shù)路線(xiàn)：

實(shí)驗結果：

1. 測序結果和質(zhì)量控制

分離培養腹部前脂肪細胞，誘導分化48小時(shí)、96小時(shí)和144個(gè)小時(shí)后取樣進(jìn)行RNA-seq，未誘導分化的細胞（0小時(shí)）作為對照。對12個(gè)樣本的文庫進(jìn)行測序得到1,300,074,582 (195.02 Gb)?clean reads。每個(gè)樣本的Q30都在92.81%以上，平均GC含量為52.51%，12個(gè)樣本的比對率在79.40和84.30%之間。

2. 前脂肪細胞lncRNA及其功能預測

經(jīng)篩選獲得了27,023個(gè)新的lncRNA?；趌ncRNA順式作用功能鑒定了4915個(gè)靶基因。進(jìn)一步通過(guò)GO分析發(fā)現總共有1746、1544和2174個(gè)基因分別被富集到生物過(guò)程、細胞組成和分子功能三個(gè)GO條目?jì)?。KEGG富集分析顯示917個(gè)基因被顯著(zhù)富集到包括Wnt、MAPK和血管平滑肌收縮通路中。

3. 腹部前脂肪細胞分化相關(guān)的差異表達lncRNAs和mRNAs分析及功能注釋

將分化0、2、4、6天的前脂肪細胞樣本進(jìn)行兩兩比較(A0?vs. A2；A0 vs. A4；A0 vs. A6；A2 vs. A4；A2 vs. A6和A4 vs. A6)得到了1,336個(gè)差異表達lncRNA和1,759個(gè)差異表達mRNA，在各個(gè)階段差異表達的基因(Differential expression, DEGs)的數量隨著(zhù)細胞分化而下降(Figure 4)。3095個(gè)DEGs的GO分析結果顯示生物過(guò)程分類(lèi)的前三個(gè)富集條目是細胞代謝過(guò)程、細胞過(guò)程和電子傳遞鏈。在分子功能分類(lèi)中前三個(gè)富集條目是轉移酶活性、蛋白結合和核苷結合。在細胞組分類(lèi)別中前三個(gè)富集條目是細胞質(zhì)部分、細胞質(zhì)和胞外區。通路分析結果顯示丙酸代謝、脂肪酸代謝，內質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解途徑被顯著(zhù)富集。此外，通過(guò)k-means均值聚類(lèi)，3,095個(gè)差異基因被聚成8個(gè)表達模式。其中，K2這一簇基因中在前脂肪細胞分化中起著(zhù)重要作用。

Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) at?different stages.

4. 共表達網(wǎng)絡(luò )和模塊構建

對3095個(gè)DEGs的共表達網(wǎng)絡(luò )分析鑒定出10個(gè)關(guān)聯(lián)模塊（figure 6B）。隨后對這些模塊進(jìn)行了基于特征向量基因的聚類(lèi)分析，10個(gè)模塊被分為四組：第一是藍綠色模塊；第二：紅色，棕色，粉紅色的模塊；第三模塊，包括紫色和紅色；第四組為藍色，黑色，綠色，黃色的模塊（figure 6C）。屬于同一組的模塊可能具有相同或相似的功能和調節機制。

Figure 6 Visualization of construction of the coexpression network.

5. 時(shí)期特異性模塊的鑒定和可視化

使用加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析（WGCNA），鑒定了與A0（第0天），A2（第2天）和A6（第6天）階段相關(guān)的6個(gè)階段特異性模塊，這些模塊的表達模式可能在脂肪細胞分化中發(fā)揮重要作用（figure 6B, D）。

6. 核心和高度相關(guān)基因的鑒定

在黑色、藍色、綠色和黃色四個(gè)高度相關(guān)的模塊中鑒定了五個(gè)共同的基因。這表明xloc_068731，xloc_022661，染色質(zhì)解旋酶DNA結合蛋白6（CHD6），幼蟲(chóng)巨大致死基因同源物1（llgl1），以及Neuralized?E3泛素蛋白連接酶1b（neurl1b）可能在A(yíng)2分化階段扮演重要的角色。在棕色模塊，Kelch家族成員38（klhl38）和xloc_045161為高度相關(guān)的mRNA與lncRNA，表明其潛在的脂肪細胞分化調控作用在A(yíng)6階段。肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白6同源物（actr6）和xloc_070302是A0時(shí)期與分化調節相關(guān)的重要調節因子（Figure 8）。

Figure 8 Visualization of connections of genes in various modules.

7. 階段特異性模塊基因的GO和通路分析

GO分析顯示，RNA代謝過(guò)程、調節定位、及細胞代謝過(guò)程均在A(yíng)0期富集；前體代謝物質(zhì)和能量產(chǎn)生，電子傳遞鏈，有機物氧化的能量產(chǎn)生在A(yíng)2階段高度富集；囊胚發(fā)育和細胞過(guò)程均在A(yíng)6階段富集。在通路分析中， A0和A6階段沒(méi)有鑒定出顯著(zhù)的通路。A0階段的前三個(gè)通路是卵母細胞減數分裂，溶酶體，和半乳糖代謝；而不飽和脂肪酸合成，細胞凋亡，和丙酸代謝是A6階段的前三個(gè)通路。A2階段氧化磷酸化被顯著(zhù)富集。

8. RT-PCR驗證差異表達基因

選取用于RNA-seq的樣本中的核心和高度相關(guān)基因XLOC_045161, XLOC_070302, XLOC_068731, XLOC_022661,ACTR6, CHD6, LLGL1和NEURL1B進(jìn)行RT-PCR驗證，實(shí)驗結果與RNA-Seq結果一致（Figure 9）。

Figure 9 Validation of highly connected genes using RT-qPCR. *P ＜0.05, **P＜0.01.

結論：經(jīng)RNA-seq和篩選在雞前脂肪細胞中獲得了27,023個(gè)新的lncRNA。不同分化階段的前脂肪細胞兩兩比較總計鑒定出3095個(gè)DEGs，它們參與甘油脂代謝、mTOR、PPAR和MAPK信號通路。通過(guò)RT-PCR鑒定和驗證了8個(gè)階段特異性模塊中的高度相關(guān)基因，實(shí)驗結果與RNA-Seq結果一致。

創(chuàng )新點(diǎn)：

這項研究第一次分析了雞腹部脂肪前體細胞分化過(guò)程中lncRNA和mRNA的表達。首次報道了一些與前脂肪細胞分化相關(guān)的通路，包括丙酸代謝，脂肪酸代謝和氧化磷酸化途徑，為進(jìn)一步研究雞的lncRNA提供了寶貴的資源，有利于更好的了解雞的前脂肪細胞分化。

 

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