1、轉化株構建與篩選

1）使用MISSA系統構建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重組質(zhì)粒，采用農桿菌介導轉化方法將兩個(gè)抗旱相關(guān)目標基因插入東北栽培品種水稻KY131基因中，構建OsbZIP46CA1、APK6雙基因轉化株。另外，也使用同樣的轉化體系分別構建了上述兩個(gè)基因的單基因轉化株。

2）通過(guò)southern-blot雜交技術(shù)，鑒定T0初始轉化株中插入基因的拷貝數，挑選插入基因單拷貝的T0的T1子代初步鑒定具備抗旱性狀的轉基因株（肉眼觀(guān)察）。

3）最終篩選得到一個(gè)在生殖器官發(fā)育階段抗旱強于非轉基因株的雙基因轉化株XL22，見(jiàn)圖1B。

4）利用熒光定量PCR技術(shù)，檢查了XL22轉基因株及其對應的單基因轉化株中的插入基因是否過(guò)表達，如圖1C所示，上述轉化株中插入基因均出現了預期的轉錄水平。

5）以OsbZIP46CA1的下游調控基因Rab21、Rab16B的轉錄水平，轉化株對ABA的敏感性來(lái)判斷插入基因是否發(fā)揮作用，如圖1C所示，轉化株中點(diǎn)的Rab21、 Rab16B轉錄水平均出現上調，且轉化株對ABA更加敏感，說(shuō)明上述轉化株中的插入基因均能正常發(fā)揮作用。

2、XL22轉化株抗旱能力評估

a）生殖生長(cháng)期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）、KY-131-N（非轉基因株）4組材料，每組4個(gè)獨立生物學(xué)重復，孕穗期缺水處理14天，比較不同材料之間的單株產(chǎn)量、灌漿速率、穗數、小穗花數、圓錐花序數、單位面積產(chǎn)量6個(gè)指標。如圖3所示，無(wú)論是肉眼觀(guān)察（3A、3B）結果，還是上述6個(gè)指標（3C）統計結果，都表明XL22在抗旱性上要優(yōu)于單基因轉化株與非轉基因株。

b）種子發(fā)育期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）3組材料（4葉齡），每組3個(gè)生物學(xué)重復，7天缺水處理，觀(guān)察恢復給水7天后的葉片卷曲情況，統計存活率。如圖4A所所示，恢復給水7天后，XL22相較于單基因轉化株，葉卷曲更加輕微，如圖B所示，XL22的存活率也要顯著(zhù)高于單基因轉化株。另外，如圖4所示，XL22離體葉片子在室內環(huán)境下，脫水速度也顯著(zhù)低于其他材料。該結果表明，XL22在種子發(fā)育階段的抗旱能力也要強于單基因轉化株。

3、XL22轉化株耐熱、抗寒能力評估

分別取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4葉齡種子材料，每個(gè)3個(gè)生物學(xué)重復，均進(jìn)行42℃ 12小時(shí)，4℃5天處理，最后正常環(huán)境下生長(cháng)7天，觀(guān)察這各材料之間的葉卷曲清苦以及存活率，結果顯示，XL22表現為個(gè)更高的存活率（圖5C)，更加輕微的葉片卷曲（圖4A），表明XL22相較于單基因轉化株與非轉基因株擁有更強的耐熱、抗寒能力。

4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子學(xué)機制

a）為了分析XL22抗旱表型后的基因調控網(wǎng)絡(luò )，研究者分別對XL22、 CA1-OE、SAPK6-OE 3個(gè)轉化株系在正常給水與相同缺水處理條件下的材料進(jìn)行了轉錄組測序，取樣部位為倒二葉，每個(gè)處理設置兩個(gè)生物重復，測序使用illumina Hiseq平臺，PE150讀取方式，數據分析在百邁客云計算平臺（www.holisticcircumcision.com）完成。

b）分析結果顯示，XL22的缺水處理相較于正常給水組材料，2977個(gè)基因轉錄水平顯著(zhù)上調，3243個(gè)顯著(zhù)下調；CA1-OE中，2962個(gè)基因轉錄上調， 3514個(gè)基因轉錄下調；SAPK6-OE中，3433個(gè)基因轉錄上調，3472個(gè)基因轉錄下調（FDR < 0.01, |FC| > 2）。大部分的轉錄上調基因在3個(gè)材料之間是共有的，如圖6B所示，表明這些上調基因在水稻干旱脅迫響應中功能比較保守。

c）由于轉基因材料中過(guò)表達基因為bZIP家族轉錄因子及其活性激活基因家族，研究者重點(diǎn)關(guān)注了3個(gè)材料中轉錄上調的基因，這些基因被劃分為4類(lèi)：Group1，XL22相較于CA1-OE特有上調基因，645個(gè)；Group2,XL22相較于SAPK6-OE特有上調基因，500個(gè)基因特異上調；Group3，CA1-OE相較于SAPK6-OE特有上調基因，398個(gè)；Group4，SAPK6-OE相較于CA1-OE特有上調基因，869個(gè)。Group I主要分布在“Response to ABA”、“Regulation of Plant-type Hypersensitive response”等GO term；Group II主要分布在“Organic Substance Biosynthetic Process” 、“Salicylic Acid Biosynthetic Process” 、“Regulation of Hydrogen Peroxide Metabolic Process”等GO term；Group3主要分布在“Gene Expression and Regulation”、 “Nitrate Related Metabolic Process” 、 “Carbohydrate Biosynthetic Process” 等GO term；Group4主要分布在 “Cytokinesis and Cell Proliferation”、“Microtubule Related Process”、“Response to Abiotic Stress” 等GOterm（見(jiàn)圖6C）。因此推測，XL22中的兩個(gè)基因可能激活了不同的干旱脅迫應答基因。

d）為了揭示GroupI 、Group2兩個(gè)基因集內部的基因調控關(guān)系，研究者基于STRING數據庫分別繪制了上述兩個(gè)基因集內部基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò )圖。如圖7所示，GroupI蛋白互作網(wǎng)絡(luò )中包含481個(gè)PPI（protein-protein intereaction，PPI），Group2中包含280個(gè)PPI。其中，有6個(gè)基因在蛋白互作網(wǎng)絡(luò )中均處于非常中心的位置（與之互作蛋白數量越多，越靠近中心位置）。其中，3個(gè)（LOC_Os12g13720, ?LOC_Os03g58800, ?LOC_Os09g31486) 在兩個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò )中均處于中心位置，分別編碼 PDR ABC transporter, a ATPase, and a DnaK/Hsp70s family protein,可能在干旱應答過(guò)調控網(wǎng)絡(luò )發(fā)揮著(zhù)非常關(guān)鍵的；其他3個(gè)基因（Group1特異：LOC_Os04g42260 ?LOC_Os02g38580，Group2特異：LOC_Os05g03050）分別編碼protein phosphatase、Rad51、Hsp90 ，從功能可以看出，它們與水稻干旱應答同樣相關(guān)。

1. 構建了抗旱OsbZIP46CA1+SAPK6雙基因轉化水稻XL22。
2. 揭示了XL22抗旱表型后部分分子調控機制，為之后進(jìn)一步的分析調控機制研究提供參考信息。

研究中涉及到的轉錄組數據分析，從下機數據質(zhì)控、與參考基因組比對，到基因轉錄水平定量、差異表達分析，到最后共表達分析、蛋白互作分析，均是該實(shí)驗室的同學(xué)們在百邁客云平臺的有參轉錄組APP提供的圖形化界面下自主完成的，該步操作無(wú)需編程語(yǔ)言基礎，無(wú)需linux系統命令行界面下軟件安裝、調試與運行經(jīng)驗，更重好的是無(wú)需等待，基礎分析7天完成，個(gè)性化分析幾分鐘人機交互完成1次，你要做的只是網(wǎng)頁(yè)下簡(jiǎn)單幾步便可完成數據導入、參數設定、任務(wù)運行、結果查看、數據后期挖掘等數據分析步驟。