09月01 【成功案例】云平臺助力爪蟾卵母細胞m6A修飾mRNA功能研究

分子生物學(xué)的中心法則中，遺傳信息從DNA傳遞給RNA再流向蛋白質(zhì)，此過(guò)程中RNA不僅發(fā)揮遺傳信息傳遞的作用，還負責調控各種生物學(xué)過(guò)程。早在40年前研究者就發(fā)現mRNA存在類(lèi)似于基因組DNA和組蛋白上可逆的表觀(guān)遺傳修飾（其中N6-methyladenosine m6A是最常見(jiàn)的一種轉錄后修飾，介導了超過(guò)80%的RNA堿基甲基化），但當時(shí)并不清楚RNA這種修飾的具體功能，隨著(zhù)近期研究的深入逐漸揭開(kāi)了mRNA甲基化的神秘面紗，它可以參與調控基因表達，并進(jìn)一步調節細胞的分化和發(fā)育。對mRNA甲基化相關(guān)的轉錄組測序數據的分析當然離不開(kāi)便捷、可靠的數據深度挖掘工具啦！近期百邁客云平臺Blast小工具助力孫青原老師關(guān)于m6A參與調節爪蟾卵母細胞減數分裂成熟和胚胎發(fā)育的文章發(fā)表于“Journal of biological chemistry”雜志。接下來(lái)，小編跟大家分享這篇文章。

N6-methyladenosine seqencing highlights the involvement of mRNA methylation in oocyte meiotic maturation and embryo development by regulating translation in Xenopus laevis

N6-甲基腺苷測序揭示mRNA甲基化通過(guò)調節非洲爪蟾的翻譯水平參與卵母細胞減數分裂成熟和胚胎發(fā)育

PMID: 27613873

雜志：Journal of biological chemistry (JBC)

影響因子：4.12

材料方法

1.實(shí)驗材料：

GV期和MII期爪蟾卵母細胞。

2.測序方法：

提取GV期和MII期爪蟾卵母細胞總RNA后分別進(jìn)行m6A-seq測序。

技術(shù)路線(xiàn)

實(shí)驗結果

1. GV期和MII期爪蟾卵母細胞的m6A-seq

對GV期和MII期爪蟾卵母細胞的m6A修飾mRNAs進(jìn)行分離和測序分析后與X. laevis轉錄組比對，鑒定了4207條甲基化修飾的mRNAs（GV期4128條；MII期3820條）。根據m6A峰的高度，作者把這些mRNAs分為三類(lèi)：高m6A mRNAs、中m6A mRNAs和低m6A mRNAs。通過(guò)這些結果發(fā)現從GV期到MII期有1674個(gè)mRNAs保持甲基化修飾水平，此外有2400條mRNAs的m6A水平下降、133條mRNAs的m6A水平升高(Figure 1A)。

利用m6A峰值對應序列，作者預測了爪蟾中保守的m6A基序。與人和小鼠中相似，爪蟾中mRNA甲基化也發(fā)生在GGACU基序(Figure 1B)。研究還發(fā)現m6A峰主要分布在編碼DNA序列（CDS）的下游位置的CDS末端位點(diǎn)附近(Figure 1C)。

?Figure 1. Summary of the m6A modified mRNAs in X. laevis oocytes.

2. 爪蟾中甲基化mRNAs相關(guān)通路的基因集富集分析

為了研究RNA甲基化是否參與卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育，作者利用DAVID工具對m6A修飾mRNA進(jìn)行了KEGG通路分析。結果高或者中等甲基化的mRNAs主要富集在ErbB、孕激素介導的卵母細胞成熟和細胞周期等通路中。但是，低甲基化的mRNAs主要被富集在RNA降解、DNA復制、核糖體、剪接體、磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑相關(guān)通路中。

為了進(jìn)一步評估這些m6A修飾在非洲爪蟾卵母細胞的生物學(xué)功能，作者利用biocloud平臺的BLAST工具對爪蟾mRNAs進(jìn)行了注釋(www.holisticcircumcision.com)。GO注釋的結果顯示，卵母細胞m6A甲基化mRNAs主要與生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，如：轉錄、蛋白磷酸化和細胞分裂。

3. mRNAs甲基化與蛋白翻譯間的關(guān)系

為了探索mRNAs甲基化是否與翻譯有關(guān)，作者把mRNA甲基化數據與Smits等人已發(fā)表的轉錄組和蛋白組數據進(jìn)行了整合。通過(guò)BLAST分析，在RNA/蛋白數據中找到了723個(gè)m6A修飾mRNAs的信息。GV期或者M(jìn)II期卵母細胞中高m6A峰的RNA水平（log10 RNA RPKM值）比總RNA高（在卵或者胚胎中），但是蛋白水平（log10 protein amount / fmol）比總蛋白水平低（Figure 2）。與高度甲基化的mRNAs相比，低甲基化RNAs顯示出非常高的表達水平（Figure 3）。這些結果說(shuō)明在卵母細胞或早期胚胎中，m6A修飾可能與mRNA翻譯有關(guān)。

Figure 2. Scatter plot of the m6A modified mRNAs in the transcriptome/proteome data.

Figure 3. Box plot of the RNA levels and protein levels of m6A modified mRNAs.

為了分析mRNA甲基化的位置（5UTR, CDS和3UTR）與翻譯的關(guān)系，作者提取了GV期卵母細胞5UTR、5’末端CDS、3’末端CDS或者3UTR位置高度甲基化的mRNA信息（Figure 4）。結果顯示5CDSs或3CDSs甲基化的mRNAs顯示出較低的蛋白表達水平。此外，3UTR甲基化的mRNAs顯示出較高的蛋白表達水平。這些數據說(shuō)明CDS區域RNA甲基化可能抑制mRNA翻譯。

Figure 4. The RNA levels and protein levels of hypermethylated mRNAs in GV oocytes.

結論：在爪蟾GV期和MII期的卵母細胞中鑒定了4207個(gè)甲基化的mRNA。整合mRNA甲基化數據、轉錄組數據和蛋白組數據后發(fā)現，盡管RNA水平?jīng)]有顯著(zhù)差異，高度甲基化的mRNAs與低甲基化的mRNAs相比顯示較低的蛋白表達水平。研究還發(fā)現低甲基化的mRNAs主要富集在細胞周期和翻譯信號通路中，而高甲基化水平的mRNAs主要與蛋白磷酸化有關(guān)。本文結果表明卵母細胞減數分裂成熟與早期胚胎發(fā)育時(shí)期的mRNA甲基化可以調節翻譯和細胞分裂。