10月26 【成功案例】油菜分枝角度轉錄調控研究

題目：mRNA-miRNA整合分析揭示BR、auxin信號通路參與調控油菜分蘗（分枝）角度

發(fā)表雜志：Int J Mol Sci ?影響因子：3.226

研究背景

油菜是全球范圍內非常重要的一種油料作物，隨著(zhù)人口的增加與可用耕地面積的減少，最大限度提高包括油菜在內的各類(lèi)作物的產(chǎn)量成為了育種學(xué)家考慮的一個(gè)重要問(wèn)題。增大單位土地上的種植密度是一種增加作物產(chǎn)量的策略，每棵植物生長(cháng)所需的地上面積主要由側枝的數量、長(cháng)度與著(zhù)枝角度決定，這些因素中，對側枝及葉子著(zhù)枝角度的研究對于植物的高密度種植策略的應用具有重要的意義。

在以往的研究中已經(jīng)發(fā)現，水稻中的LAZY1,、TILLER ANGLE CONTROL1、PROSTRATE GROWTH1、 LOOSE PLANT ARCHITECTURE1基因，玉米中的ZmTAC1、ZmLAZY1基因，擬南芥中的 AtLAZY1 、 AtLPA1基因均參與調控了葉子或側枝的著(zhù)枝角度。在代謝物水平，通常認為葉或枝的著(zhù)枝角度與植物生長(cháng)素（ auxin）、油菜內脂素（Brassinosteroids，BR）的在組織中的不均勻分布有關(guān)系。

在植物中，一些microRNA也被發(fā)現與auxin調控網(wǎng)絡(luò )或者分蘗角度相關(guān)，比如，miR393通過(guò)auxin調控網(wǎng)絡(luò )影響葉與根的形態(tài)結構；miR164可降解轉錄因子NAC1轉錄本，從而下調植物對auxin的響應水平，抑制植物側根的發(fā)育；auxin響應基因ARF8、ARF6在大部分物種中被miRNA167調控；水稻中，過(guò)表達miR160，水稻分蘗角度增大。

目前，油菜中對分蘗角度的研究還比較少，本研究組之前基于F2群體，使用BSA混池性狀座位定位策略，鑒定到了一個(gè)與auxin合成相關(guān)，且可能參與了側枝著(zhù)枝角度調控的基因BnaYUCCA6。

該研究通過(guò)對分枝角度有顯著(zhù)差異的兩種油菜品系進(jìn)行mRNA與microRNA高通量測序，來(lái)進(jìn)一步探討油菜中與分蘗角度相關(guān)的分子調控機制。

 

材料與方法

材料：

油菜品系6098B（較大分枝角度，約52度）

油菜品系Purler（較小分支角度，約22度）

方法：

測序類(lèi)型：mRNA、microRNA高通量測序

測序平臺：illumina Hiseq 2000測序平臺

取樣方法：兩個(gè)品系的均取抽薹時(shí)期與花發(fā)育早期兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分枝發(fā)生部位。每個(gè)品系每個(gè)時(shí)期1個(gè)樣本（每個(gè)個(gè)體至少取5個(gè)分枝發(fā)生部位，最多6個(gè)個(gè)體混樣樣本），總共4個(gè)樣本，每個(gè)樣本分別進(jìn)行mRNA測序與microRNA測序

數據分析平臺：百邁云數據分析平臺（http://www.holisticcircumcision.com/）

Figure 1

技術(shù)路線(xiàn)

結果：mRNA測序與分析

a）每個(gè)樣本測序得到~6Gbase 可用數據，與參考基因組比對率~80%。

b）差異表達基因篩選（EBseq，FDR < 0.05 & |FC|>2)：如圖2A所示，抽薹期，兩個(gè)品系間檢測得到5908個(gè)差異表達基因；花發(fā)育早期，兩個(gè)品系間檢測到5397個(gè)差異表達基因。其中3261個(gè)為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有差異表達基因。

c）對上述3261個(gè)共有差異表達基因進(jìn)行GO功能分析，如圖2B所示，差異基因在biological adhesion、biological phase、and locomotion、 macromolecular complex、cell junction、and nucleoid 、nuclear and protein binding transcription factor activity and receptor activity等GO term上有顯著(zhù)富集。

d）對兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，其中3297個(gè)基因注釋到了KEGG數據庫 ，其中大多數基因注釋到了 ribosome 、oxidative phosphorylation相關(guān)代謝通路。值得注意的是，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別有58、51個(gè)差異基因注釋到了植物激素信號通路，進(jìn)一步分析發(fā)現，這些通路大多為BR或auxin信號轉導通路。該部分結果如圖3所示。

Figure 3

e）圖4展示了在BR生物合成、BR信號轉導通路、auxin信號轉導通路上鑒定到的差異表達基因。這些差異基因中，BR6OX調控了BR生物合成過(guò)程中multiple C-6C的氧化過(guò)程；DWRF1催化24-methylenecholesterol轉化為campesterol，該過(guò)程為BR生物合成的第一步；分布在BR信號轉導通路上的差異基因包括 BRI1, BSK, BZR1, and CYCD3等, 這些基因多在品系 Purler中下調 (見(jiàn)圖 5E)；分布在 auxin 信號轉導通路上的基因包括 AUX1, IAA, GH3, ARF等，其中 IAAs, GH3s, ?ARFs 在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 Purler品系材料中均表現為上調。

結果：miRNA測序與分析

a）每個(gè)樣本測序得到~7M ?可用reads，長(cháng)度分布在18nt到30nt之間。

b） 鑒定得到202個(gè) microRNAs, 包括 85 個(gè)miRbase注釋的已知microRNA， 111 具有穩定發(fā)卡前體結構的新型 microRNA。

c） IDEG6軟件分析（ |FC| >2)進(jìn)行差異表達分析，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)在兩個(gè)品系間分別檢測得到45、65個(gè)差異表達microRNA。值得注意的是，如圖7所示，除了miR1140 與miR827, 抽薹時(shí)間點(diǎn)上的所有已知 差異表達miRNAs 均在 品系Purler中上調，這其中包括3個(gè)miR156 家族 與6個(gè) miR395 家族microRNA，相反，花發(fā)育早期時(shí)間點(diǎn)上的所有差異表達miRNAs 均在 品系Purler中下調。

e）為了分析差異表達microRNA的生物學(xué)功能，使用TargetFinder軟件對所有差異表達microRNA進(jìn)行了靶基因預測，得到的一些靶基因參與了分枝角度調控，比如， ?miRX215的兩個(gè)靶基因與擬南芥中 ?organellar (peroxisome, glyoxysome) 3-ketoacyl-CoA thiolase編碼基因同源； miRX115.1 的3個(gè)靶基因與擬南芥中 ATP-dependent caseinolytic (Clp) protease編碼基因同源。

結果：miRNA-mRNA聯(lián)合分析

大部分的miRNA與其對應的靶基因在表達量上均呈負相關(guān)，比如， miR156 在Purler品系中轉錄上調, 其對應的大部分的 靶向 SPL 基因在Purler品系中表現為下調； ?miR395 與miR319 在Purler品系中轉錄上調 ，其對應的靶基因包括 Sulfate Transporter (SULT) 、TEOSINTE-BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF (TCP)表現為相反的趨勢，這些結果說(shuō)明，本研究中的mRNA-seq、microRNA-seq結果均比較可靠。轉錄水平表現為相反趨勢的的miRNA-gene 可用于后期進(jìn)一步更加深入的挖掘油菜分枝背后的microRNA-mRNA調控網(wǎng)絡(luò )。

 

結論

鑒定得到了一些分布在BR、auxin生物合成或者是信號轉導通路上的差異表達基因與microRNA，這些基因或者microRNA可作為與油菜分枝角度調控相關(guān)的潛在基因集，為后續更加深入的相關(guān)分子學(xué)機制研究提供了數據支持。