10月31 【成功案例】通過(guò)全基因組Bisulfite測序技術(shù)研究羊卵巢DNA甲基化與生產(chǎn)力之間的關(guān)系

通過(guò)全基因組Bisulfite測序技術(shù)研究羊卵巢DNA甲基化與生產(chǎn)力之間的關(guān)系

雜志：BMC Genomics

影響因子：3.729

PMID：28969601

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背景

DNA甲基化是一種表觀(guān)遺傳學(xué)的調控機制，在生物學(xué)調控過(guò)程中起著(zhù)重要的作用，比如基因表達、基因印記、細胞分化和胚胎發(fā)生以及決定生物的表型和可塑性。甲基化發(fā)生在胞嘧啶殘基的CpG核苷酸上。目前，哺乳動(dòng)物中，通過(guò)高通量測序進(jìn)行全基因組甲基化探索重要的生物學(xué)功能的技術(shù)被廣泛應用。對農戶(hù)而言，羊的生產(chǎn)效率以及產(chǎn)仔次數是重要的經(jīng)濟回報指標。通常情況下，生殖性狀的遺傳性在中等及以下，并且對表型選擇的效果并不顯著(zhù)。因此，研究生殖能力相關(guān)的基因信息可以提高選擇效率。繁殖能力由卵巢濾泡調控，該過(guò)程被精確的增殖和分化事件調控。近期的研究主要集中在DNA甲基化如何調控卵巢的形成和生殖系統發(fā)育上。一些證據表明，卵巢的發(fā)育受DNA甲基化的調控。通過(guò)對豬的卵巢甲基化分析發(fā)現，在豬的性別和卵巢發(fā)育成熟過(guò)程中存在甲基化的改變。在山羊下丘腦甲基化研究中也存在類(lèi)似的結果。盡管有這些發(fā)現，但是想弄清楚DNA甲基化模式與生產(chǎn)力之間的關(guān)系仍然有局限。湖羊被公認為生殖系統成熟早且生產(chǎn)能力強，然而，最近幾年的研究中，更多的注意力集中在肉質(zhì)上，選擇過(guò)程中關(guān)注生殖特征的研究相對較少。繁殖是一個(gè)復雜的過(guò)程，例如產(chǎn)仔數量這一特征受許多微效基因和一些主要基因的影響。所以了解DNA甲基化在基因功能中的作用非常必要。該研究中選用WGBS的技術(shù)對湖羊甲基化進(jìn)行研究，系統的分析了DNA甲基化模式與產(chǎn)仔數量的潛在關(guān)系。另外，此項研究也可以增加對湖羊甲基化的認知和了解。

材料和方法

實(shí)驗材料：共選取6只湖羊（Hu sheep ），年齡3歲，非妊娠母羊，分為兩組：

HP組（高生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有3次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=3）

LP組（低生產(chǎn)力組）：3只湖羊，有1次產(chǎn)仔記錄（n=3，litter size=1）

分別將處于發(fā)情期的母羊在12小時(shí)內進(jìn)行屠殺，收集身體同側的卵巢，迅速用液氮冷凍， -80?°C儲存，分別提取DNA和RNA，DNA進(jìn)行bisulfite處理。

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司 IlluminaHiSeq 2500平臺，兩組分別選取3個(gè)樣本進(jìn)行WGBS測序，兩組總RNA進(jìn)行轉錄組測序

分析平臺：所有數據在百邁客云平臺（BMKCloud）進(jìn)行分析，分析內容如下：

1.參考基因組比對

測序片段在進(jìn)行甲基化分析之前需要與參考基因組比對，通過(guò)bisulfite處理和PCR擴增將未甲基化的胞嘧啶（C）轉換成胸腺嘧啶（T）。應用Bismark 軟件將bisulfite處理的片段與參考基因組（Oar_v3.1）比對，其他數值均選用百邁客云平臺的默認參數。用該軟件進(jìn)行測序深度和覆蓋度的統計，以及bisulfite轉化率統計，甲基化類(lèi)型確定。Bismark 軟件不能辨別單個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，參數設置為coverage ≥ 4×，FDR< 0.05。

2.評估甲基化水平以及鑒定DMRs

使用MOABS軟件對覆蓋度大于10X的胞嘧啶位點(diǎn)進(jìn)行DMRs（差異甲基化區域）分析，運用如下公式：

3.DMGs（差異甲基化基因）生物信息分析

將DMGs與GO,COG,KEGG數據庫進(jìn)行比對分析這些基因的功能，進(jìn)行GO富集分析，以及應用KOBAS軟件對KEGG通路中顯著(zhù)富集的差異表達基因進(jìn)行檢測。并且利用String數據庫對選取的DMGs進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò )分析。

結果

1.DNMTs表達水平

首先用qRT-PCR的方法分別對HP組和LP組卵巢中DNMTs（DNMT1, DNMT3A和?DNMT3B）表達水平進(jìn)行了分析，發(fā)現HP組中DNMT1和?DNMT3A的表達水平顯著(zhù)低于LP組(P < 0.05)。

圖1.?HP組和LP組卵巢DNMTs的表達水平分析

2.DNA甲基化比對以及甲基化模式分析

HP組和LP組每個(gè)樣平均產(chǎn)生的clean數據分別是63.59G和66.72G。比對率在71.36%-74.68%之間。平均每個(gè)組中胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化率在3.5%左右。

表1.全基因甲基化測序結果

該研究中發(fā)現了3種甲基化的模式：CG，CHG(H 表示?A，C或?T), 和?CHH，這些類(lèi)型在HP和LP兩個(gè)組的比例是非常相似的。HP組中：89.78% CG，?2.46% CHG，?7.76% CHH；LP組中：88.60% CG，2.66% CHG，8.74% CHH。

圖2.甲基化模式分析

3.甲基化序列偏好性分析

通過(guò)小提琴作圖分析，圖中不同的點(diǎn)代表不同的甲基化水平，且通過(guò)橫截面積可以看出CG甲基化類(lèi)型的數量較多，而CHG和CHH甲基化類(lèi)型的數量較低。通過(guò)各樣本染色體甲基化圖譜的分析發(fā)現，染色體中大多數超甲基化胞嘧啶是CG類(lèi)型的，并且不同組中染色體上的胞嘧啶甲基化位點(diǎn)有差異，如18號染色體。另外，研究者還分析了sequence context和甲基化偏好性之間的關(guān)系，統計了所有可能的9個(gè)堿基序列甲基化百分比，mC位點(diǎn)處于超甲基化狀態(tài)中，CAG是CHG甲基化位點(diǎn)中絕大多數共同序列motif，并且兩個(gè)組中CHH contexts的頻率不一樣。

圖3.各樣本甲基化分布小提琴圖

4.不同功能區域DNA甲基化水平

研究者將所有的mC分為啟動(dòng)子、5 ’UTR、外顯子、內含子、3 ’UTR這幾個(gè)基因功能區域，通過(guò)這些功能區域對甲基化水平進(jìn)行評估。兩組中，各區域表現出相似的甲基化水平，并且CG類(lèi)型的甲基化水平高于CHG和CHH類(lèi)型。mC的大部分位點(diǎn)發(fā)生在內含子、外顯子（第一個(gè)外顯子除外）及下游區域。此外，在第一個(gè)外顯子中CG甲基化水平低于除上游區域以外的其他部分，上游區域的甲基化水平表現出下降的趨勢，TSS（轉錄起始位點(diǎn)）附近的CG位點(diǎn)甲基化水平低于首個(gè)外顯子區域的甲基化水平。另外，在外顯子和內含子中檢測到高度甲基化，并且這種甲基化水平從啟動(dòng)子區到TSS區逐漸下降，從TSS區到內含子去逐漸增加。CHH類(lèi)型是低甲基化一類(lèi)并且在各功能區域較穩定，CHG類(lèi)型幾乎未甲基化。

圖4.CGI不同功能趨勢圖

5.CGI區域甲基化注釋

CGI（CG島）區域功能注釋發(fā)現，約68%超甲基化CGI分布在基因間區，1.5%的超甲基化CGI分布在UTR區，在兩個(gè)組中沒(méi)有顯著(zhù)差異（P > 0.05）。

圖5. 不同功能部分CGI甲基化分布比例

6.HP組和LP組DMRs分析

檢測兩組DMRs以及根據不同的甲基化類(lèi)型進(jìn)行基因功能注釋。共鑒定了70,899個(gè) CG 類(lèi)型DMRs，?16 個(gè)CHG類(lèi)型 DMRs以及356個(gè) CHH 類(lèi)型DMRs。大多數在基因間區，5 ’ UTR 和?3 ’ UTR分別只有33和162個(gè)DMRs?；谒械募谆?lèi)型，除基因間區外內含子中DMRs的比例最高。研究人員還對兩組DMRs進(jìn)行了熱圖聚類(lèi)分析。

圖6.不同基因功能區不同甲基化模式中DMRs比例

7.測序結果驗證

為了驗證測序結果，從測序結果中隨機選取10個(gè)DMGs進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗，結果顯示HP組中GPNMB，ELK4，?BACH1，?CDIPT表達水平顯著(zhù)低于LP組，而SCYL1表達水平顯著(zhù)高于LP組（P < 0.05），兩組中?ABCG2，mTOR，STK3，?ACVR1 和?PSMD7的表達水平?jīng)]有明顯差異（P ?> 0.05），與測序結果相符，該結果說(shuō)明測序數據是可信的。

8.DMGs數據庫富集分析：COG，GO和KEGG

為探索生產(chǎn)力功能基因在甲基化狀態(tài)下的變化。通過(guò)COG，GO和KEGG數據庫分析，在DMRs中檢測到12832個(gè)DMGs，在COG分析中，DMGs富集在GC的功能預測上；GO分析發(fā)現與CG類(lèi)型相關(guān)，DMGs主要富集在細胞遷移，解剖結構形成，細胞突出，細胞器內膜結合類(lèi)別；KEGG分析發(fā)現與CG類(lèi)型相關(guān)。此外，研究者還發(fā)現一些DMGs主要與雌性性腺發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，包括：卵泡發(fā)育(GO: 0001541)，卵泡排卵(GO:0001542)，卵泡生長(cháng)(GO:0001547)，黃體化(GO:0001553)，排卵周期過(guò)程(GO:0022602)，性腺發(fā)育負調控(GO:2,000,195)，這些特殊的基因受DNA甲基化影響，可引起卵巢濾泡的發(fā)育，最終影響母羊的生產(chǎn)力。

圖7.COG，GO，KEGG富集分析

9.DMGs和羊生產(chǎn)力相關(guān)分析

為了更進(jìn)一步了解DNA甲基化和不同生產(chǎn)力之間的關(guān)系，研究者限定兩個(gè)因素進(jìn)行相關(guān)分析。第一，兩組的DMGs必須在GO分析中富集在雌性繁殖相關(guān)路徑。第二，在KEGG通路中（除疾病和癌癥以外的路徑），選擇的DMGs在兩組中必須有顯著(zhù)差異（P < 0.05）。結果顯示有28個(gè)基因符合這兩個(gè)標準，之后用STRING數據庫對這些基因進(jìn)行分析。如下圖所示：基因網(wǎng)絡(luò )分析中，研究者關(guān)注了這些DMGs相關(guān)的5個(gè)或更多基因。BMP7，BMPR1B，?CTNNB1，FST，FSHR，?LHCGR，TGFB2和?TGFB3是這個(gè)網(wǎng)絡(luò )的中心，都與雌性繁殖路徑相關(guān)。

圖8. DMGs和生產(chǎn)力相關(guān)STRING分析

結論

首先，該研究用qRT-PCR的方法分別對HP組和LP組卵巢中DNMTs表達水平進(jìn)行了分析，發(fā)現HP組中DNMTs的表達水平顯著(zhù)低于LP組。

其次，揭示了湖羊卵巢中胞嘧啶甲基化率在3.5%左右，以及3種甲基化模式（CG，CHG和?CHH），以CG模式為主。

另外，通過(guò)啟動(dòng)子、5 ’ UTR、外顯子、內含子、3 ’ UTR這些功能區域對甲基化水平進(jìn)行評估，發(fā)現兩組中各區域表現出相似的甲基化水平。通過(guò)CGI區域功能注釋發(fā)現，約68%超甲基化CGI分布在基因間區。

最后，該研究通過(guò)COG，GO和KEGG數據庫分析，在DMRs中檢測到12832個(gè)DMGs，其中一些DMGs主要與雌性性腺發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。最終尋找28個(gè)與DNA甲基化和生產(chǎn)力之間高度相關(guān)的基因。該結果證實(shí)了DNA甲基化有助于更好的理解表觀(guān)遺傳學(xué)在羊的生產(chǎn)能力中的調控作用。

 

創(chuàng )新點(diǎn)

該研究從表觀(guān)遺傳學(xué)的角度出發(fā)，揭示了甲基化與湖羊生產(chǎn)力大小之間的關(guān)系，為材料的選擇提供了理論依據，為湖羊產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益的提升提供了有利條件。