10月31 【成功案例】湖羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中全基因組范圍LncRNAs的顯著(zhù)變化

Genome-Wide Analysis Reveals Extensive Changes?in LncRNAs during Skeletal Muscle Development?in Hu Sheep

湖羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中全基因組范圍LncRNAs的顯著(zhù)變化

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雜志：?genes?

影響因子：3.600

PMID:?28763026

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研究背景：

羊肉具有蛋白含量高、脂肪和膽固醇含量低等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)羊的肌肉生長(cháng)可提高羊肉產(chǎn)量。過(guò)去關(guān)于羊骨骼肌生長(cháng)的研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因，然而基因組絕大部分是非編碼序列。長(cháng)非編碼RNA（lncRNAs）是一種重要的非編碼RNA，越來(lái)越多研究發(fā)現某些功能型的lncRNAs是新的肌肉調節元件，發(fā)揮重要作用。關(guān)于羊肌肉相關(guān)lncRNA的轉錄組學(xué)研究較少，尤其關(guān)于湖羊的研究更少， lncRNA在羊骨骼肌生長(cháng)過(guò)程中的表達類(lèi)型和潛在作用大部分都是未知的，因此了解羊不同生長(cháng)時(shí)期肌肉轉錄組的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。

本文擬研究湖羊三個(gè)關(guān)鍵生長(cháng)階段（110天胎兒期，5天幼年期，2歲成年期）肌肉lncRNA的表達模式和潛在作用，篩選差異表達lncRNA的和DEGs（差異表達基因）的靶基因。同時(shí)通過(guò)lncRNA-gene網(wǎng)絡(luò )預測湖羊肌肉生長(cháng)的lncRNA潛在調控因子，獲得湖羊肌纖維生長(cháng)相關(guān)的轉錄水平的候選調節因子。

材料和方法

材料：相同的自然光環(huán)境下飼養的胎兒期、幼年期、成年期湖羊，每個(gè)時(shí)期選取3個(gè)隨機樣本，取既定部位（12和13胸椎之間）的LD肌肉樣本，采樣后即刻液氮冷凍提取RNA。

測序平臺：Illumina platform

分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud），分析內容如下：

在百邁客云平臺上，對胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉細胞進(jìn)行RNA-seq測序后轉錄組拼接。進(jìn)行注釋后，先排除＜200個(gè)核苷酸或單外顯子的轉錄子,再用CPC,CNCI,PFAM,CPAT等工具從未知轉錄組中篩選候選lncRNA。四種方法FPKM＞0.1的轉錄子交集定義為lncRNA轉錄子。

應用DEGseq packages (1.10.1)?來(lái)分析組間的表達差異，FDR值＜5%，log2(倍數變化)的絕對值被定義為差異化表達。

預測差異表達的lncRNA的順式靶基因和反式靶基因。

為分析lncRNA的主要功能，通過(guò)NCBI的Nr、GO、KEGG、COG數據庫比對進(jìn)行靶基因和DEGs注釋?zhuān)琄S≤0.05，信號通路矯正p值≤0.05的GO term被定義為顯著(zhù)富集的。

為進(jìn)一步研究lncRNA和他們的靶基因的相互作用，建立LncRNA-Gene共表達網(wǎng)絡(luò )。

結果：

1.測序拼接和轉錄組分析

胎兒期、幼年期、成年期3組RNA-seq序列質(zhì)控后，經(jīng)過(guò)去接頭、多聚尾、低質(zhì)量序列后，每組平均獲得了65578070，65591958,71241551的拼接序列，9個(gè)文庫平均GC含量為54.39%，每個(gè)樣本Q30值≥91.71%，?92%以上與O. aries參考基因組特異性匹配，分析顯示胎兒期有45.1%的序列與外顯子區域匹配，后期階段匹配度更高（幼年期53.8%、成年期53.7%），在幼年、成年期組的內含子和基因間序列比例低于胎兒期。（表1）

表1.矯正后序列與不同階段湖羊參考基因組比對

2.lncRNA篩選和特征性描述
為研究湖羊肌肉lncRNA的基本特征，篩選lncRNA并與mRNA比對。CPC、CNCI、PFKM、CPAT交集部分有6924個(gè)lncRNA轉錄子，包括已知的保守lncRNA，肌肉分化相關(guān)的lncMD（圖1A）

圖1 A 韋恩圖 ?圖1B. lncRNA和mRNA在每個(gè)染色體上的分布比例。紅色和黑色線(xiàn)條分布代表lncRNA和mRNA，藍色線(xiàn)條代表相應染色體在基因組中的大小比例

lncRNA轉錄子分為4606個(gè)lincRNA（66.5%），1131個(gè)內含子lncRNA（16.3%）,1187個(gè)反義lncRNA（17.1%）。與mRNA類(lèi)似，lncRNA轉錄子在26對染色體和X染色體中分布廣泛，但線(xiàn)粒體中不存在。而且lncRNA在幾個(gè)染色體中的比例與染色體大小比例一致，尤其是18號染色體，表明在此研究中相應lncRNA可能體現重要功能（圖1B）

比較lncRNA和mRNA的外顯子特征，結果顯示大部分lncRNA每個(gè)轉錄子包含2-5個(gè)外顯子（均值3.3），比mRNA少（均值7.9，圖1C）

圖1C 湖羊lncRNA每個(gè)轉錄子外顯子數 ?????圖1D 湖羊lncRNA外顯子大小分布

另外大部分lncRNA包含2個(gè)外顯子，而包含2個(gè)外顯子的mRNA僅占比3.9%，明顯低于lncRNA。lncRNA中外顯子平均長(cháng)度相對長(cháng)于mRNA，大部分小于200bp（圖1D）。與蛋白編碼基因一致，在肌肉生長(cháng)過(guò)程中同一階段lncRNA表達趨勢相似，且平均表達水平比與蛋白編碼基因低（圖2A,B）

每組重復間的相關(guān)性分析顯示相關(guān)性高（圖3A-C），而且在6924個(gè)表達的lncRNA轉錄子中，于某一生長(cháng)階段特異性表達的占比33.03%，這個(gè)比例在蛋白編碼基因中較低（4%），提示lncRNA的特殊意義和動(dòng)態(tài)特性。胎兒期特異性lncRNA為1042個(gè)，遠高于幼年期（626）和成年期（619），表明lncRNA在早期發(fā)展階段的重要意義。

圖2A胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉lncRNA的FPKM分布

圖2B胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉蛋白編碼基因的FPKM分布

圖3 每組重復間的相關(guān)系數分析（A胎兒期組，B幼年期組，C成年期組）

3.差異表達分析及靶點(diǎn)基因預測

3個(gè)時(shí)期兩兩比較分析顯示在胎兒期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎兒期vs成年期（對照組vs實(shí)驗組），分別有27、14、92個(gè)lncRNA，239 270 1437個(gè)基因是特異性表達的。(|log2FC| > 1, FDR < 0.05).值得一提的是，幼年期vs成年期組差異表達的lncRNA量最低，在胎兒期vs幼年期組和幼年期vs成年期組，DEGs的數量幾乎一樣多，表明產(chǎn)前和產(chǎn)后盡管在時(shí)間只相差1一個(gè)月，但是轉錄水平的差異較大（圖4A-D）。

圖4 對比組差異表達lncRNA和基因的數量（A 不同對比組差異表達lncRNA數量的韋恩圖 B 不同對比組DEGs數量的韋恩圖C不同對比組差異表達lncRNA總數 D不同對比組DEGs總數）

差異表達的lncRNA中，在胎兒期vs幼年期有36個(gè)上調lncRNA，42個(gè)下調lncRNA，幼年期vs成年期有13個(gè)上調lncRNA，28個(gè)下調lncRNA，胎兒期vs成年期有68個(gè)上調lncRNA，78個(gè)下調lncRNA。DEGs中，胎兒期vs幼年期組有1028個(gè)上調基因和487個(gè)下調基因、幼年期vs成年期組有659個(gè)上調基因和900個(gè)下調基因、胎兒期vs成年期有1862個(gè)上調基因和1749個(gè)下調基因。差異表達的lncRNA和DEGs的分層集群顯示幼年期和成年期的表達模式相似而與胎兒期有所差異（圖4E,F）。

圖4 E 差異表達的lncRNA的分層集群 ?F DEGs的分層集群

為進(jìn)一步評估RNA測序的結果，選擇MYOG(從胎兒期富集的與晚期肌肉細胞分化相關(guān)的基因)，MYH7(肌肉結構基因)，5種差異表達的lncRNA，4種DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析。表達量與RNA-Seq結果一致。結果表明表達與測序結果有較好相關(guān)性，表明測序結果可行度高。

lncRNA可以通過(guò)與靶基因順式和反式作用發(fā)揮功能，通過(guò)兩兩對比分析，預測相鄰上下游100kb的和或差異表達lncRNA的互補蛋白編碼基因。得到共201個(gè)靶基因。

圖5 qRT-PCR和RNA-Seq分別驗證不同時(shí)期湖羊肌肉差異表達lncRNA和基因的表達水平

4.差異表達的lncRNA和mRNA靶基因的生信分析

為進(jìn)一步研究差異表達的lncRNA,通過(guò)與NR / GO/ COG和KEGG數據庫比對，對lncRNA和DEGs的靶基因做注釋。

表2 差異表達lncRNA和DEGs的功能注釋

基于GO數據庫，靶基因和DEGs被分別歸到生物學(xué)過(guò)程，細胞構成，分子功能三個(gè)功能類(lèi)別，而且在所有比對中，在肌肉生長(cháng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的器官形成，骨骼肌系統發(fā)展與應激被歸類(lèi)為顯著(zhù)富集的GO terms。

圖6不同對比組的差異表達lncRNA和基因的靶基因的top GO分析（A不同對比組的差異表達lncRNA top20個(gè)GO terms B不同對比組的DEGs top20個(gè)GO terms）

COG功能聚類(lèi)分析把差異表達的lncRNA和基因分別歸為17和24個(gè)類(lèi)別。在胎兒vs幼年期組，氨基酸轉運合成，碳水化合物轉運合成，離子轉錄合成的靶基因和DEGs的比例比其他兩個(gè)對比組高，提示這類(lèi)基因在產(chǎn)前階段肌肉發(fā)育過(guò)程中的重要性。此外，對靶基因和DEGs分析顯示，在幼年期vs成年期組信號轉導機制和細胞骨架比其他對比組比例更高，表明這類(lèi)terms和相應基因在產(chǎn)后肌肉生長(cháng)中的重要意義（圖7）。

圖7 差異表達lncRNA和DEGs的靶基因的COG分類(lèi)（A 差異表達lncRNA的靶基因的COG分析 BDEGs的靶基因的COG分析）

 

根據KEGG分析，胎兒組vs幼年組，幼年組vs成年組，胎兒組vs成年組的21、6、51個(gè)lncRNA的靶基因分別與40、16、48個(gè)通路對應。雖然每個(gè)對比組的差異表達lncRNA的靶基因數量少，通路（MAPK信號通路，間隙結合，鈣信號通路，胰島素信號通路，激動(dòng)蛋白細胞骨架調節）是可被誘導的。這些通路中，MAPK信號通路在胎兒組vs幼兒組，胎兒組vs成年組中最常見(jiàn)，提示此通路和相關(guān)lncRNA可能參與了湖羊肌肉的生長(cháng)調控。

在胎兒期vs幼年期，胎兒期vs成年期對比組，氧化磷酸化，碳代謝和心肌收縮是DEGs數量最高的前三個(gè)通路，在幼年期vs成年期組卻不是。值得注意的是，途徑如糖酵解和生成，脂肪酸降解，氨基酸合成的和過(guò)氧物酶體增殖激活受體?(PPAR)信號通路特異性存在于胎兒期vs幼年期組，提示這些途徑中DEGs在早期肌纖維生長(cháng)過(guò)程中的重要作用。此外磷酸肌醇激酶-3-激酶蛋白激酶B(PI3k-Akt)信號通路和類(lèi)固醇合成在幼年期vs成年期組中特異性存在，強化了它們在產(chǎn)后肌肉生長(cháng)中的作用?？傊?，差異表達的lncRNA和DEGs在肌肉生長(cháng)調節方面顯示了巨大潛力。

表3 不同對比組的DEGs的KEGG通路

5.肌纖維增長(cháng)相關(guān)的潛在功能性lncRNA篩選

為研究lncRNA如何與靶基因來(lái)調節肌肉生長(cháng)，依據FPKM進(jìn)行差異表達lncRNA和對應的差異表達靶基因的共表達分析,共獲得了15（胎兒組vs幼年組），7（幼年期vs成年期），37（胎兒期vs成年期）個(gè)共調節的lncRNA-基因對。三個(gè)網(wǎng)絡(luò )都顯示了與肌肉生長(cháng)相關(guān)的候選lncRNA（圖8）。差異表達的lncRNA和相應的差異表達的順式和反式作用的靶基因來(lái)構建lncRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò )。差異表達的靶基因直接與肌肉生長(cháng)過(guò)程相關(guān)，對靶基因對應的差異表達lncRNA也進(jìn)行了分類(lèi)。

圖8 不同對比組lncRNA-基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò )

（A胎兒期/幼年期組，B幼年期/成年期組，C胎兒期/成年期組；基因以紫色表示，lncRNA以綠色表示，上調用三角形表示，下調用圓形表示，順式作用實(shí)心線(xiàn)表示，反式用虛線(xiàn)表示）

隨后通過(guò)GO分析得到了8個(gè)生物學(xué)過(guò)程和相關(guān)20個(gè)mRNA和41個(gè)lncRNA，如RTL1和JPH2(表S5)。

qRT-PCR分析顯示在肌肉生長(cháng)過(guò)程中lncRNA表達和對應靶基因變化一致，包括TCONS_00606329和它的靶基因elastin，TCONS_00758916、?TCONS_00685981 和他們的靶基因phosphofructokinase?muscle and ankyrin repeat?SOCS box containing 8; TCONS_00297401和靶基因泛素特異性蛋白酶2編碼基因，
TCONS_00377352, TCONS_00381991、TCONS_00381994和他們的靶基因RTL1 (圖?9)?。這些結果進(jìn)一步揭示了lncRNA和他們靶基因的互作關(guān)系。

圖9胎兒期、幼年期、成年期差異表達lncRNA和共表達的靶基因的表達水平的qRT-PCR驗證

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研究結論

本研究基于Illumina平臺，篩選出一系列與湖羊三個(gè)關(guān)鍵生長(cháng)時(shí)期相關(guān)的lncRNA和基因，篩選得到的6924個(gè)差異表達的lncRNA轉錄子中，特異性表達于某一生長(cháng)階段的占比高于蛋白編碼基因（33.03%：4%），提示lncRNA的特殊意義和動(dòng)態(tài)特性。且在胎兒期階段特異性lncRNA數量較多，提示lncRNA在早期發(fā)展階段的重要意義。

通過(guò)兩兩比較分析篩選特異性表達的lncRNA和基因，在胎兒期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎兒期vs成年期（對照組vs實(shí)驗組）分別得到特異性表達的27、14、92個(gè)lncRNA，239 270 1437個(gè)基因。差異表達的lncRNA和DEGs的分層集群顯示幼年期和成年期的表達模式相似，與胎兒期有差異。

選擇MYOG，MYH7，5種差異表達的lncRNA，4種DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析。表達量與RNA-Seq結果一致，測序結果可信度高。

通過(guò)與NR，GO,COG,KEGG數據庫進(jìn)行比對，對差異表達lncRNA和基因的靶基因進(jìn)行了多種肌肉相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的注釋。且構建了lncRNA-gene 共調控網(wǎng)絡(luò )，提供了候選lncRNA的有價(jià)值的信息，?qRT-PCR分析顯示在肌肉生長(cháng)過(guò)程中lncRNA表達和對應靶基因變化一致。

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創(chuàng )新點(diǎn)

首次對三個(gè)關(guān)鍵生長(cháng)階段的湖羊肌肉生長(cháng)相關(guān)lncRNA進(jìn)行系統性描述。從轉錄子結構和表達模式上研究lncRNA，然后進(jìn)一步預測lncRNA的靶基因來(lái)進(jìn)行功能研究。為進(jìn)一步研究湖羊lncRNA功能提供了依據，為促進(jìn)湖羊肌肉生長(cháng)提供了有價(jià)值的信息。