從GEO數據庫中下載得到Ying等人上傳的原始測序數據（GSE53960）。數據集中包含來(lái)自32只大鼠的320個(gè)bodymap樣本(每只大鼠包含腎上腺、腦、心臟，腎、肝、肺、骨骼肌、脾臟、胸腺、睪丸或子宮10種不同器官)的轉錄組測序數據。Ying等選取了2周、6周、21周和104周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死雌、雄兩只大鼠，進(jìn)行四次生物學(xué)重復。

技術(shù)路線(xiàn)：

實(shí)驗結果：

1.大鼠非編碼基因表達譜

為了獲得大鼠非編碼基因表達譜的概覽，作者首先提取了FPKM>0.01?的3,458個(gè)非編碼基因的表達值，其中54.8%(1,895)是假基因、33.5%(1,158)是miRNA、6.8%?(237)是lncRNA（Fig.1a）。分層聚類(lèi)分析顯示，非編碼基因的表達譜明顯按器官類(lèi)型聚類(lèi)，比編碼基因表現出更高的器官特異性。PVCA分析發(fā)現在數據集中方差貢獻率最多高的是器官（62.94%）（Fig.1b）。在非編碼基因表達譜的總體方差中年齡（2.82%）貢獻率超過(guò)了性別（0.13%）貢獻率（Fig.1d）。

Figure?1.?Expression?profiling?of?noncoding?genes

?2.年齡和性別相關(guān)非編碼基因的差異表達分析

?利用Cuffdiff對非編碼基因在基因和轉錄水平進(jìn)行了分析。統計結果發(fā)現，除腎上腺和心臟外雄性大鼠比雌性大鼠共享更多的發(fā)育階段依賴(lài)性DEnGs。所有組織中DEnGs的數目從19（雌性大鼠腦）到503（睪丸）不等（Fig.2a）。腎上腺、心、腎、肝、肌肉和胸腺表現出相當數量的發(fā)育階段依賴(lài)性DEnGs，腦和肺中DEnGs的數量最少。

性別相關(guān)的DEnGs不僅取決于器官，還與年齡相關(guān)。脾臟中性別相關(guān)的DEnGs數量最多的，而肺中最少，在所有發(fā)育階段中腎上腺和胸腺顯示相當一致的DEnGs數量。在幼鼠的大多數器官中性別特異性非編碼基因大量表達，而青春期的大鼠性別特異性的非編碼基因表達較少。幼鼠大腦中性別相關(guān)DEnGs的數量最多，這可能與發(fā)育早期大腦快速的發(fā)育速度有關(guān)（Fig.2b）。

Figure?2.?Identification?of?differentially?expressed?noncoding?genes

?3.腦和睪丸中有大量非編碼基因表達

?當比較不同器官對時(shí)，DEnGs的數量有了很大的變化。四個(gè)發(fā)育階段中腦和肝臟與其他器官相比時(shí)獲得了相對較多的DEnGs。睪丸和胸腺中DEnGs的數量表現出明顯的年齡依賴(lài)性。與其他器官相比，第6和21周的大鼠睪丸中存在最大數量的DEnGs(Fig.?2c)。

4.共表達網(wǎng)絡(luò )的構建

為了注釋大鼠非編碼基因功能，作者構建了蛋白編碼基因和非編碼基因之間的共表達網(wǎng)絡(luò )，包含3572個(gè)與年齡相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼和非編碼基因，1603性別相關(guān)基因，和16346個(gè)器官相關(guān)的基因。并通過(guò)GO分析檢測共表達分析模塊是否富集在特定的生物學(xué)過(guò)程中。

5.年齡相關(guān)的基因共表達模塊與細胞分裂、細胞周期和免疫系統發(fā)育有關(guān)

在與年齡相關(guān)的基因共表達網(wǎng)絡(luò )中，發(fā)現了包含3572個(gè)基因的14個(gè)穩定模塊（Fig.?3c）。藍色的模塊包含1151個(gè)基因（其中有60個(gè)非編碼基因）被顯著(zhù)富集到諸如細胞周期過(guò)程，細胞分裂，有絲分裂，以及轉錄調節和RNA代謝調節GO條目中。這些條目富集結果說(shuō)明發(fā)育差異與生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中的代謝變化和基因表達調控有關(guān)。通路分析顯示細胞周期和堿基切除修復相關(guān)基因被顯著(zhù)富集，提示細胞周期和自我修復功能可能受老化影響。其他模塊如棕色和綠色顯示出另一個(gè)免疫系統相關(guān)的富集趨勢，如免疫反應、免疫系統發(fā)育和淋巴器官發(fā)育。很多腦、脾臟和胸腺中的年齡相關(guān)基因與癌癥和其他年齡相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)，這提示衰老可能是通過(guò)影響免疫系統導致這些疾病的發(fā)生。其他基因主要涉及幫助免疫系統抵御炎癥和轉移白細胞以建立機體的防御系統。最后，粉紅色模塊中的七個(gè)非編碼基因與骨骼系統的發(fā)育有關(guān)。

Figure?3.?Co-expression?network?construction?on?age-related?genes.

本文還利用相同的方法構建了器官相關(guān)和性別相關(guān)基因的共表達網(wǎng)絡(luò )，結果顯示器官相關(guān)模塊很大程度上取決于不同組織類(lèi)型的功能，性別相關(guān)模塊中包含性別發(fā)育相關(guān)基因。

6.年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析顯示樞紐編碼基因在網(wǎng)絡(luò )中的調節作用

作者通過(guò)關(guān)聯(lián)3,572個(gè)年齡相關(guān)基因中的特征向量基因研究模塊和年齡之間的關(guān)系（Fig.4a），毗鄰關(guān)系反應模塊的相關(guān)性。包含許多非編碼基因的棕色模塊與年齡有相對緊密的關(guān)系。因此選取了此模塊中189個(gè)與衰老相關(guān)的基因（包括七個(gè)非編碼基因，閾值為0.32）進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò )可視化分析，獲得了兩個(gè)主要的集群，其中有幾個(gè)中心基因連接著(zhù)相鄰基因。雖然非編碼基因不在網(wǎng)絡(luò )的中心，但是七個(gè)大鼠的非編碼基因與免疫系統相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò )運作。

Figure?4.?Network?visualization?of?age-related?brown?module.

結論：利用大鼠bodymap?RNA-seq數據構建了大鼠4個(gè)發(fā)育階段、11個(gè)組織中的3,458個(gè)非編碼基因的表達譜。構建了一個(gè)推斷蛋白質(zhì)非編碼基因生物學(xué)功能的編碼和非編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò )，年齡相關(guān)模塊被富集到免疫系統發(fā)育相關(guān)條目。年齡相關(guān)棕色模塊的可視化分析發(fā)現大鼠非編碼基因與免疫系統相關(guān)基因共同參與網(wǎng)絡(luò )運作。

創(chuàng )新點(diǎn)：本文提供了一個(gè)鑒定和注釋大鼠非編碼基因的模型，涉及到多個(gè)器官和雌雄兩性的不同發(fā)育階段。建立了一個(gè)全面、可靠的推斷多個(gè)器官之間隨發(fā)育變化的非編碼基因表達平臺，為以后大鼠中非編碼基因表達譜研究奠定了基礎。