11月16 豬植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中基因間長(cháng)鏈非編碼RNA的鑒定和功能分析
PMID:?27922056
雜志：Scientific?reports
影響因子：5.228
研究背景：隨著(zhù)高通量RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在許多物種中鑒定出了大量的基因間長(cháng)鏈非編碼RNA（lincRNAs）。有研究表明，一些lincRNA在植入前胚胎發(fā)育（PED）過(guò)程中發(fā)揮重要作用。豬是一種理想的生殖和生物醫學(xué)應用研究模型，然而對豬lincRNAs的研究還比較欠缺，因此需要對lincRNAs進(jìn)行全面的全基因組范圍鑒定。此外，合子基因組激活（ZGA）對成功的移植前胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此需要對ZGA的具體分子機制進(jìn)行研究。目前很少有研究報道豬PED中轉錄組的變化情況，對PED中lincRNAs的功能研究還很有限。
公共數據獲?。?/b>
從NCBI-SRA數據庫中下載得到五個(gè)豬RNA-Seq數據集，Supplementary?Table?S1中列出了RNA-seq數據編號和詳細信息。
Supplementary?Table?S1?Details?of?RNA-seq?data
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技術(shù)路線(xiàn)：
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實(shí)驗結果：
1.基于豬RNA-seq數據集的lincRNAs鑒定
本文利用5個(gè)包含豬各種組織或細胞的RNA-seq數據（Supplementary?Table?S1）對linckRNAs進(jìn)行了全面鑒定。經(jīng)reads?mapping和轉錄本組裝后從122,007個(gè)基因座鑒定出了195,531個(gè)轉錄本。排除已知mRNA并進(jìn)一步篩選后獲得了7,618個(gè)lincRNA。
2.豬lincRNA的結構特點(diǎn)
作者對預測獲得的lincRNAs和Ensemble中記錄的mRNAs進(jìn)行了比較，發(fā)現lincRNAs中的外顯子明顯較少(平均值：lincRNAs?2.97個(gè)、mRNAs?8.49?個(gè);?Kolomogorv-Smirnov?Test,?P-value<2.2×10?16)（Fig.?2A）。而豬lincRNAs外顯子長(cháng)度比蛋白編碼基因長(cháng)(平均值：lincRNAs?484bp、mRNAs?307bp；?Kolomogorv-
Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)（Fig.?2B）。由于較少的外顯子數量，整體lincRNA長(cháng)度小于蛋白編碼基因的轉錄本長(cháng)度(平均值：lincRNAs?1338?bp、mRNAs?2842?bp；Kolomogorv-Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)?(Fig.?2C)。
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Figure?2.?Features?of?pig?lincRNAs.
? ? ? ? 3.豬lincRNAs的低表達量和組織特異性
? ? ? ? 對不同組織和細胞系中lincRNAs的表達模式分析結果顯示lincRNAs與蛋白編碼基因相比表達量較低。為了定量評估每個(gè)轉錄本的表達特異性，作者應用依賴(lài)于Jensen-Shannon（JS）距離算法的基于熵度量法計算每個(gè)轉錄本的表達特異性。結果顯示，lincRNAs比蛋白編碼基因表現出更高的JS平均值（Fig.?3B），這說(shuō)明lincRNAs比蛋白編碼基因有更高的組織特異性。
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Figure?3.?Characteristics?of?pig?lincRNAs?expression.
? ? ? ? 4.lincRNAs與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因之間潛在的順式作用關(guān)系
? ? ? ? 研究表明，lincRNAs可能通過(guò)正、負兩種方式調節鄰近蛋白編碼基因表達。通過(guò)GO分析發(fā)現豬lincRNAs的鄰近蛋白編碼基因被富集到“轉錄調控”功能。對lincRNA與鄰近蛋白編碼基因的轉錄起始位點(diǎn)（TSSs）距離的分析發(fā)現了462個(gè)TSSs距離在4kb以?xún)鹊膌incRNA:mRNA對。值得注意的是lincRNA:mRNA對中32%的lincRNAs始于400nt內，而mRNA:mRNA對只有12%（Fig.?3D）。這些結果說(shuō)明豬的lincRNAs可以順式調節他們鄰近蛋白編碼基因的表達。
5.植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs的功能分析
過(guò)濾除去每個(gè)胚胎發(fā)育階段的低方差lincRNAs和mRNAs后,進(jìn)行了共表達網(wǎng)絡(luò )分析（WGCNA）探索豬PED過(guò)程中lincRNA的作用。通過(guò)無(wú)監督聚類(lèi)分析鑒定出了23個(gè)共表達模塊（Fig.?4A）。其中5個(gè)模塊顯示發(fā)育階段特異性（Fig.?4B），它們可能代表每一個(gè)過(guò)渡階段的核心基因網(wǎng)絡(luò )。為了進(jìn)一步預測lincRNAs在豬PED過(guò)程中發(fā)揮的功能，作者對每個(gè)階段特異性模塊進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現對應ZGA的4細胞到8細胞轉變階段的模塊被富集到轉錄調控、表觀(guān)調控和細胞周期條目中（Fig.?4C）。
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Figure?4.?Function?prediction?of?PED?associated?lincRNAs.
? ? ? ? 6.豬植入前胚胎發(fā)育樞紐?linckRNA的鑒定
? ? ? ? 為了鑒定豬PED中的樞紐linckRNA，作者利用WGCNA測量了模塊內的基因間連接，并提取了每個(gè)階段特異性模塊中的前100個(gè)樞紐基因。然后在4細胞階段特異性模塊中的樞紐基因集中選取10個(gè)lincRNAs進(jìn)行了qRT-PCR分析，發(fā)現這些lincRNAs在生殖組織中作為一個(gè)整體表達（Fig.?5A）。研究還發(fā)現在卵巢中高表達的兩個(gè)lincRNAs：tcons_00166370和tcons_00020255?在4細胞階段顯示出明顯的激活趨勢，而8細胞階段迅速下調（Fig.?5B）。盡管這些參與豬PED過(guò)程的lincRNAs的作用機制還不清楚，樞紐lincRNAs的鑒定為進(jìn)一步的功能研究提供了寶貴的資源。
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Figure?5.?The?expression?of?two?hub?lincRNAs?from?4-cell?stage-specific?module?in?different?tissues?and?PED.
結論：進(jìn)行了完整的豬lincRNAs分析，提供了首個(gè)豬植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs圖譜。WGCNA分析顯示PED相關(guān)lincRNAs與細胞周期調節、轉錄和表觀(guān)調控過(guò)程有關(guān)。對樞紐lincRNAs的qRT-PCR分析發(fā)現了兩個(gè)與PED密切相關(guān)的lincRNA：TCONS_00166370?和TCONS_00020255。