11月22 【成功案例】短期滲透脅迫下西瓜根組織的轉錄組研究

Transcriptome Profiling of Watermelon Root?in Response to Short-Term Osmotic Stress

短期滲透脅迫下西瓜根組織的轉錄組研究

雜志：?PLOS ONE

影響因子：2.806

PMID:27861528

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研究背景：

干旱是影響農業(yè)生產(chǎn)力、限制物種分布的重要因素。干旱會(huì )影響植物某些生理生化過(guò)程（如蒸騰作用、光合作用、呼吸作用、碳水化合物和激素代謝）。植物進(jìn)化出多種應對機制（包括逃旱性，避旱性和抗旱性），這種機制涉及精細復雜的代謝網(wǎng)絡(luò )及多分子通路間的相互作用。

西瓜富含必需營(yíng)養成分（如糖、番茄紅素、對心血管有益的氨基酸類(lèi)），是一種在世界范圍內廣泛種植的瓜類(lèi)作物。干旱會(huì )減少西瓜產(chǎn)量，栽培西瓜較野生西瓜抗旱性更強，但相關(guān)研究較少。M08是一種栽培西瓜近交品種，抗旱性強。為了解栽培西瓜根系對滲透脅迫響應分子機制及相關(guān)調控網(wǎng)絡(luò )，本研究進(jìn)行了滲透脅迫下西瓜根系的比較轉錄組學(xué)研究。

材料和方法

PEG6000處理的M08植株幼苗根系，依據處理0、3、6、12、24h時(shí)表型和Cla007307 (WRKY) and Cla006761 (MYB)基因轉錄水平來(lái)確定mRNA測序時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗組（T-1，T-2，T-3），與對照組(CK-1，CK-2，CK-3)一起進(jìn)行mRNA測序。

測序平臺：百邁客Illumina HiSeqTM 2500平臺

分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）具體分析如下：

矯正后clean reads比對到西瓜參考基因組（TopHat ），基于DESeq進(jìn)行差異表達基因（DEGs）分析（FC≥2，FDR＜0.01），隨后進(jìn)一步進(jìn)行GO分析、GO富集、KEGG通路分析。

研究結果：

1. 轉錄組測序時(shí)間點(diǎn)選擇

西瓜幼苗在滲透脅迫下，6h時(shí)出現枯萎，12h和24h時(shí)出現嚴重枯萎（圖1A）。 Cla006761上調并在6h時(shí)達到最高，Cla017928下調在6h達到最低值（圖1B）。結合幼苗表型及Cla017928和Cla006761的動(dòng)態(tài)表達結果，選擇處理6h的樣本進(jìn)行RNA測序。

圖1A M08幼苗在滲透脅迫處理不同時(shí)間的表型特征

圖1B 滲透脅迫下P5CS、MYB基因表達的動(dòng)態(tài)變化

2. 測序結果

6個(gè)文庫共得到32.99 Gb的clean reads，每個(gè)文庫＞40M（表1）。unique mapped reads的比例為8.513％到86.10％，測序數據質(zhì)量高。

表1.測序數據?

qRT-PCR驗證18個(gè)不同表達水平的基因，驗證結果與測序結果一致。生物學(xué)重復間相關(guān)性評估結果顯示相同處理組高度相關(guān)，CK和實(shí)驗組相關(guān)性弱。以上結果均表明測序數據結果可靠。

3. DEGs鑒定
   基于DESeq進(jìn)行DEGs分析，共鑒定出滲透脅迫下5246個(gè)差異表達基因，其中2753個(gè)上調，2493個(gè)下調。DEG包含大量不同的基因，說(shuō)明西瓜根系對干旱響應涉及復雜的調控機制。
4. GO分類(lèi)和KEGG分析

將DEGs在與COG（2174），GO（4528），KEGG（1203），Swiss-Prot（3954）、NR（5173） 比對后，共注釋了5175個(gè)DEG?。用BLAST2GO檢索GO數據庫中的DEG并用WEGO進(jìn)行GO功能分類(lèi)。將4528個(gè)DEG歸為以下三類(lèi)：生物學(xué)過(guò)程（4148），分子功能（3670）和細胞成分（4177）（圖2）。

圖2.GO分類(lèi)

富集的GO terms包含缺水響應、高滲鹽度響應、乙烯響應。此外幾個(gè)高度富集的terms（植物型超敏響應調節、損傷響應、真菌防御響應、防御響應突發(fā)性呼吸）在西瓜根部不同脅迫響應中相互作用，與其他植物中的結果一致。

一些與根生長(cháng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程是顯著(zhù)抑制的，如細胞增殖、分生組織生長(cháng)調節、有絲分裂細胞周期的G2/M轉換、細胞板形成的胞質(zhì)分裂、核糖體生物起源、核糖體、微管、翻譯、DNA復制調控、DNA復制起始等。說(shuō)明PEG誘導的滲透脅迫可能會(huì )抑制西瓜根系生長(cháng)。

植物激素在不同脅迫響應中起重要作用，本研究中大部分涉及激素介導的信號傳導途徑、乙烯響應、水楊酸生物合成過(guò)程的基因表達上調。
蛋白折疊影響蛋白質(zhì)功能，破壞內質(zhì)網(wǎng)腔蛋白折疊的多種信號可激活未折疊的蛋白質(zhì)發(fā)生響應，甚至致使細胞程序性死亡（PCD）。內質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)響應是本研究中高度富集的term，表明滲透脅迫會(huì )影響蛋白折疊。在滲透脅迫時(shí)，根尖分生組織自噬PCD激活，根尖優(yōu)勢喪失，根系結構發(fā)生重構來(lái)適應滲透脅迫。富集到的GO terms包含細胞程序性死亡調節、根形態(tài)發(fā)生，表明滲透脅迫下PCD程序可能在根尖分生組織中激活，同時(shí)發(fā)生根系結構重構。
KEGG分析結果顯示共825個(gè)分配到108個(gè)不同的生化途徑。DEG最多的前5個(gè)途徑分別是核糖體、植物激素信號轉導、植物病原體相互作用、嘌呤代謝、淀粉蔗糖代謝途徑（圖3）。其中核糖體途徑變化顯著(zhù)。大部分核糖體通路中的基因都是下調的，與GO分析結果一致。

圖3.KEGG分析

 

5. 滲透脅迫響應的保護基因

參與滲透調節的基因

在滲透脅迫條件下，相容性溶質(zhì)分子（如脯氨酸，甜菜堿和海藻糖）會(huì )增加，來(lái)維持細胞膜結構，細胞膨壓和水平衡。P5CS是高等植物脯氨酸合成的限速酶，鳥(niǎo)氨酸氨基轉移酶（OAT）是脯氨酸合成鳥(niǎo)氨酸途徑中的脯氨酸合成酶。在滲透脅迫下，根中P5CS（Cla017928）和OAT（Cla019569）表達下調。而編碼脯氨酸脫氫酶的Cla016474（ProDH）上調。在滲透脅迫下TPS基因（Cla019181，Cla010101和Cla009709）和TPP基因（Cla005675，Cl008123，Cla006270和Cla014481）表達上調，參與蔗糖和肌醇半乳糖苷代謝的基因顯著(zhù)上調，另外四個(gè)淀粉酶基因也是上調的。

活性氧（ROS）清除

ROS是有氧代謝過(guò)程中重要信號轉導分子及毒副產(chǎn)物。非生物脅迫（如干旱、高鹽、洪水、寒冷和炎熱）會(huì )擾亂細胞代謝平衡，致使植物ROS生成過(guò)量，從而損傷蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物和DNA。突發(fā)性呼吸氧化酶同系物（Rboh）蛋白與ROS產(chǎn)生有關(guān)。植物進(jìn)化出一些高效酶（如超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，過(guò)氧化物酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶），以及非酶抗氧化劑（ASH、GSH）來(lái)清除過(guò)量的過(guò)氧化物自由基。在本研究中，編碼Rboh的四個(gè)基因顯著(zhù)上調?？箟难徇^(guò)氧化物酶，谷胱甘肽還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶，脫氫抗壞血酸還原酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以及大部分谷胱甘肽-S-轉移酶和過(guò)氧化物酶基因表達上調，但超氧化物歧化酶基因Cla011317表達下調。這些結果表明滲透脅迫可能誘導復雜的抗氧化網(wǎng)絡(luò )。此外也富集到與維持細胞氧化還原穩態(tài)相關(guān)的硫氧還蛋白和谷氧還蛋白相關(guān)轉錄本。

其他滲透保護相關(guān)DEGs

MATE是一組新發(fā)現在脅迫響應中發(fā)揮重要作用的轉運蛋白。本實(shí)驗共得到18個(gè)MATE轉運蛋白相關(guān)的DEG。水通道蛋白是一種膜蛋白，能促進(jìn)水分跨膜轉運并維持細胞水平衡。本研究中，共8個(gè)編碼水通道蛋白的基因顯示出差異表達。LEA蛋白是重要的細胞脫水保護蛋白，其表達量與耐脫水性相關(guān)，在滲透脅迫下有兩個(gè)LEA（Cla015386和Cla009416）上調。此外編碼分子伴侶（如熱休克蛋白（HSP），分子伴侶，DnaJ樣蛋白）的DEGs也是差異表達的。

6. 蛋白激酶，磷酸酶和轉錄因子相關(guān)的DEGs

滲透脅迫誘導植物中的鈣信號，本研究涉及Ca2 +結合蛋白的DEGs在滲透脅迫下表達上調。Map激酶級聯(lián)成員在滲透脅迫中起重要作用，本研究檢測到13個(gè)編碼MAP激酶的DEGs，幾個(gè)與SnF1相關(guān)蛋白激酶，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶有關(guān)的DEGs表達上調。在磷脂信號系統中，磷脂酶催化IP3和DAG等信使形成以調節脅迫響應基因的表達。在本研究中檢測到與磷脂酶相關(guān)的DEGs（包括PLA、PLC、PLD）。許多功能基因的表達主要受特定轉錄因子調控。我們結果中也列出了轉錄因子家族的DEGs。

? ? 7.植物激素相關(guān)DEG
植物激素介導植物對生物/非生物脅迫的響應，對于植物適應環(huán)境變化具有重要意義。本研究結果中列出了與脫落酸（ABA），生長(cháng)素，細胞分裂素，赤霉酸（GA），乙烯和茉莉酸（JA）等植物激素信號相關(guān)的DEGs。

編碼ABA生物合成關(guān)鍵酶NECD的Cla009779和Cla005404基因表達上調，與乙烯合成相關(guān)基因（如ERF轉錄因子、ACS、ACO等）的表達上調。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物中的主要生長(cháng)素，由色氨酸（Trp）依賴(lài)/非依賴(lài)性途徑合成。YUC家族和TAA家族的色氨酸氨基轉移酶是Trp依賴(lài)途徑中的IAA生物合成中的關(guān)鍵酶。我們結果中，兩個(gè)YUC和一個(gè)TAA表達下調，生長(cháng)素轉運蛋白基因如LAX和PIN表達也下調。GA是調控植物生長(cháng)發(fā)育的重要植物激素，本研究中編碼GA生物合成關(guān)鍵酶的基因（Cla021351）表達下調，而編碼GA2-氧化酶（GA2ox）的轉錄本表達上調，這可能使GA的內源性水平和生物活性下降。此外，茉莉酸和細胞分裂素的生物合成途徑的轉錄本也受到滲透脅迫的影響。

? ? ?8.其他DEGs
許多與細胞分裂和根生長(cháng)相關(guān)的DEGs表達下調，如CYC、CDK、MAP、Ran、E2F、DOF、核糖體、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等。

泛素26S蛋白酶體系統（UPS）可去除非生物脅迫導致的錯誤折疊或損傷蛋白質(zhì)。E3連接酶除在UPS中發(fā)揮重要作用外，還可調節ABA依賴(lài)的應激信號。本研究得到了許多E2結合酶、E3-蛋白連接酶相關(guān)的DEG，說(shuō)明滲透脅迫可誘導UPS去除機制和E3調節機制的發(fā)生。

結論：

滲透脅迫影響西瓜的生長(cháng)、品質(zhì)和產(chǎn)量。增強西瓜對高鹽，缺水等因素引起的滲透脅迫耐性是提高生存率的有效途徑。根系是重要的吸水組織，參與滲透脅迫的初始反應。為了更好地闡述西瓜根系組織應對短期滲透脅迫的分子機制，將西瓜自交系M08用20％的PEG6000處理6h，未處理根組織作對照，進(jìn)行了全基因組差異基因表達分析。RNA-seq得到32.99Gb的高質(zhì)量數據。數據集闡述了基因表達譜，鑒定出5246個(gè)差異表達的基因，GO富集和KEGG分析表明，短期滲透脅迫影響滲透調節，信號轉導，激素應答，細胞分裂，細胞周期和核糖體等過(guò)程，M08根組織對短期滲透脅迫響應適應過(guò)程與滲透調節，ROS清除、滲透脅迫信號轉導和根系生長(cháng)抑制等通路有關(guān)（圖4）。

圖4.滲透脅迫下西瓜根系DEGs總覽

創(chuàng )新點(diǎn)：

這是第一個(gè)栽培西瓜品種根系滲透脅迫響應的比較轉錄組學(xué)研究，為深入探討西瓜根系滲透脅迫響應分子機制提供了新的思路。

參考文獻：

Yang Y, Mo Y, Yang X,?et al. Transcriptome Profiling of Watermelon Root in Response to Short-Term Osmotic Stress.[J]. Plos One, 2016, 11(11):e0166314.