11月29 【成功案例】云平臺深度解析-小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在侵染初始階段的轉錄組學(xué)變化

云平臺深度解析–小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在侵染初始階段的轉錄組學(xué)變化

Transcriptional responses of wheat?and the cereal cyst nematode?Heterodera?avenae during their?early contact stage

小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在侵染初始階段的轉錄組響應

雜志：?Scientific Reports?

影響因子：4.259

PMID:29101332

 

研究背景：

植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)（PPNs）已給許多植物帶來(lái)了巨大損害。禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)Wollenweber隸屬禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)（CCNS），出現在80％的中國小麥種植區，致使小麥感染并減產(chǎn)30％到100％。許多寄生線(xiàn)蟲(chóng)可繁殖幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)用感官定位宿主，這種復雜的行為與感官能力（如嗅覺(jué)、味覺(jué)、溫濕度感應）有關(guān)?？稍谥参锔颗c線(xiàn)蟲(chóng)初始接觸過(guò)程中采取措施進(jìn)行預防，因此了解寄生蟲(chóng)宿主互作機制具有重要意義。過(guò)去大部分研究集中在線(xiàn)蟲(chóng)侵染宿主后不同階段的轉錄組學(xué)分析，而沒(méi)有關(guān)于侵染前（早期接觸階段）互作機制的探討。今年11月3日中國農業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的老師們在Scientific Reports 發(fā)表了一篇關(guān)于小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在接觸早期轉錄響應機制的研究，填補了國內外研究空白，第一次對小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)互作早期轉錄組響應進(jìn)行了系統性的描述。

 

材料和方法

實(shí)驗組：Wenmai19小麥幼苗（根長(cháng)2–3 cm ）與J2s；對照組：僅Wenmai 19小麥幼苗或僅J2s。

處理3h后提取RNA測序。實(shí)驗組小麥根尖染色鏡檢。每組三個(gè)重復。測序后分別對小麥和線(xiàn)蟲(chóng)DEGs進(jìn)行了鑒定注釋?zhuān)€(xiàn)蟲(chóng)的效應基因進(jìn)行了預測及BT-PCD驗證。

測序平臺：百邁客HiSeq4000測序平臺

分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）

研究結果：

1.轉錄組分析采樣時(shí)間點(diǎn)確定

CCN易感小麥品種Wenmai19吸引禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)J2s。小麥根尖周?chē)奂腏2線(xiàn)蟲(chóng)數量在3h達到峰值，且J2s未滲入根內部。選擇此時(shí)小麥根、線(xiàn)蟲(chóng)樣品進(jìn)行轉錄組分析。

2.小麥根尖轉錄組數據

實(shí)驗組、對照組小麥根尖樣本共得到52.23 Gb的clean reads，每個(gè)樣本≥8.25Gb，Q30≥90.4％。每個(gè)樣品的clean reads與小麥參考基因組比對效率為64.0％至67.3％，并與唯一或多基因組位置匹配（表1）。小麥轉錄組中，共發(fā)現109,496個(gè)unigenes，包括9152個(gè)新基因。與Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等數據庫比對后，共注釋了6,780個(gè)新基因。數據重復性較好。

表1 小麥參考基因組比對結果

3.小麥基因表達響應分析

實(shí)驗組、對照組基因表達分析得到93個(gè)差異表達的unigenes（66個(gè)下調，27個(gè)上調），FDR<0.05和FC≥1.5（圖1）。對12個(gè)DEGs進(jìn)行了qPCR驗證，其中11個(gè)DEG的表達模式與mRNA測序結果一致。結果表明即使未受感染，J2線(xiàn)蟲(chóng)在小麥根部聚集也會(huì )觸發(fā)小麥的響應。

圖1 實(shí)驗組對照組小麥DEGs的火山圖

功能注釋的結果表明，所有的DEG都能與Nr數據庫比對上，其中一些在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG數據庫中也有注釋信息（表2）。

表2 小麥與禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的DEGs的功能注釋

GO富集分析將小麥DEGs分為28個(gè)功能組，歸為3大類(lèi)：生物學(xué)過(guò)程（60個(gè)）、細胞成分（54個(gè)）、分子功能（68個(gè)）（圖2a）。

圖2a小麥根尖unigenes 和DEG unigenes的GO分類(lèi)

在生物過(guò)程類(lèi)別中，與所有小麥根的unigenes相比，大部分DEG與代謝過(guò)程、單一生物過(guò)程、對刺激的反應相關(guān)。細胞成分類(lèi)別中更多DEGs位于細胞外區域。 在分子功能類(lèi)別，與所有unigenes相比，DEG更多富集于營(yíng)養儲存活性，抗氧化活性，電子載體活性，酶調節活性和催化活性等GO分類(lèi)。

KEGG通路分析來(lái)確定DEGs的生物學(xué)功能。將31個(gè)DEG分配到21個(gè)KEGG通路（圖3a）。最多數量DEGs歸類(lèi)于苯丙素生物合成通路，其次是谷胱甘肽代謝，苯丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝。6個(gè)DEG與苯丙烷相關(guān)通路有關(guān)，在線(xiàn)蟲(chóng)侵染的小麥根中全部下調，其中兩個(gè)基因Traes_1AS_F9013A945和Traes_2AS_EE549925C，經(jīng)qPCR驗證有相似的表達模式。

圖3a.小麥根尖DEGs的KEGG分析

COG注釋后，小麥29個(gè)DEGs被分為6個(gè)COG功能類(lèi)別，包括能源產(chǎn)生于轉換；次級代謝物合成運輸和代謝；僅一般功能預測；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉換，分子伴侶；氨基酸轉運代謝；碳水化合物轉運代謝（圖4a）。

圖4.DEGs的COG功能注釋 a 小麥根系 b禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)

4.小麥DEGs生物脅迫通路圖譜

MapMan分析顯示小麥許多DEGs能比對到生物脅迫通路（圖5）：29個(gè)小麥DEGs能和生物脅迫通路相關(guān)的33個(gè)數據點(diǎn)比對上，DEGs包含過(guò)氧化物酶，谷胱甘肽S轉移酶，激素信號傳導（生長(cháng)素和茉莉酸），發(fā)病相關(guān)蛋白和次級代謝物。這些DEGs大多數在生物脅迫通路中表達下調。qPCR分析其中8個(gè)DEGs，除一個(gè)之外，其他的表達模式與測序結果一致。

圖5.小麥DEGs生物脅迫通路

在氧化還原反應通路中，3個(gè)DEGs與過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉移酶通路比對上，且全部下調，表明氧化還原反應減弱。在激素信號傳導通路中，生長(cháng)素和茉莉酸（JA）通路各包含2個(gè)下調的DEGs。

有7個(gè)數據點(diǎn)與6個(gè)下調的DEGs比對上，幾乎都與苯丙素類(lèi)黃酮代謝通路有關(guān)。編碼PR蛋白的防御基因有3個(gè)下調的DEG，1個(gè)下調的DEG,與細胞壁蛋白比對上，1個(gè)表達上調的DEG與細胞壁修飾通路有關(guān)。

2個(gè)下調的DEG，2個(gè)上調的DEG可比對到蛋白酶和泛素相關(guān)蛋白水解通路。

1個(gè)上調的DEG與突發(fā)性呼吸相關(guān)，隸屬乙烯應答元件結合蛋白家族的轉錄因子，可比對到Traes_5DL_41E3B1B23基因，是一個(gè)上調DEG（注釋ERF071）。

5.CCN的轉錄組數據

實(shí)驗組、對照組CNN樣本得到30.47Gb的clean reads，每份樣本≥4.13Gb，Q30≥89.1％。共得到194,662個(gè)轉錄本和80,124個(gè)unigenes（表3）。unigenes的總長(cháng)、N50長(cháng)度、平均長(cháng)度分別為61,659,712bp，955bp、769.55bp。長(cháng)于1 kb的unigenes有15,197個(gè)。每個(gè)CCN樣本與組裝數據的比對效率在73.2％至79.2％之間。根據Nr、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam數據庫，共注釋了43741個(gè)unigenes。CCN樣本重復性良好。

表3 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的組裝轉錄本及unigene一覽

6.CCN基因對于小麥根吸引的響應分析

實(shí)驗組、對照組CNN比較得到879個(gè)DEGs（FDR <0.01和FC≥2）。867個(gè)上調，僅12個(gè)下調。對10個(gè)DEG的表達模式進(jìn)行qPCR驗證，結果與測序結果一致。表明CCNs通過(guò)小麥根的刺激激活，大部分基因上調。

DEGs的功能注釋?zhuān)珿O富集分析把258個(gè)DEGs歸類(lèi)到三大類(lèi)的36個(gè)功能組中：生物過(guò)程（159個(gè)）、細胞成分（107個(gè)）、分子功能（223個(gè)）（圖2b）

圖2b 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)unigenes 和DEG unigenes的GO分類(lèi)

KEGG分析將247個(gè)DEGs歸到125個(gè)KEGG路徑，50個(gè)最顯著(zhù)的通路中，核糖體通路有最多的DEG數（64個(gè)）(圖3b)，其他DEG較多的通路為細胞色素P450外源物代謝，谷胱甘肽代謝和Toll樣受體信號通路。表明CNN被小麥根部吸引時(shí)CNN的蛋白翻譯更活躍。

圖3b.禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)DEGs的KEGG分析

共386個(gè)DEGs歸類(lèi)于22個(gè)COG功能類(lèi)別。前四個(gè)DEG數目最多的COG類(lèi)別為僅一般功能預測（90個(gè)）；翻譯，核糖體結構和生物起源（65個(gè)）；能量產(chǎn)生與轉化（45個(gè)）；氨基酸轉運代謝（44個(gè)）（圖4b）。

7.CNN效應基因預測

搜集PPNs的351個(gè)已知效應子基因序列，并將CCN的DEGs與這些序列進(jìn)行比對。推測6個(gè)DEG與已知效應基因14-3-3，幾丁質(zhì)酶，β-1,4-內切葡聚糖酶，果膠酸裂解酶或組織蛋白酶具有同源性（表4）。比對上的效應基因的描述和DEG的Nr注釋一致。對這些DEGs結構域進(jìn)行了預測，結果也與基因描述一致（圖6，表4）。當J2線(xiàn)蟲(chóng)與小麥根接觸時(shí)，編碼候選效應蛋白的DEGs全部上調。

表4.根據禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)DEGs預測的效應基因

圖6 禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的6個(gè)候選效應基因的結構域

8.效應基因的植物防御抑制驗證

選擇兩個(gè)預測的效應基因c68622.graph_c0和c72543.graph_c0，在本氏煙草中進(jìn)行程序性細胞死亡（BT-PCD）抑制來(lái)驗證其抑制植物防御的能力。

BAX加入后，在c68622.graph_c0，沒(méi)有明顯壞死，而c72543.graph_c0則明顯壞死（圖7）。BT-PCD抑制試驗的兩個(gè)重復結果一致。表明前者抑制BT-PCD，而后者不抑制。c68622.graph_c0是來(lái)自H.avenae DEGs的候選基因，可能在抑制植物防御中發(fā)揮作用。

圖7.（a）c68622.graph_c0和（b）c72543.graph_c0在本氏煙草中BT-PCD的試驗

結論：

本文擬研究在線(xiàn)蟲(chóng)與小麥根部在早期接觸階段的相互作用機制，通過(guò)mRNA測序對小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)在接觸早期的轉錄組響應進(jìn)行了分析，鑒定了的宿主小麥根部的93個(gè)DEGs（27個(gè)上調，66個(gè)下調），寄生線(xiàn)蟲(chóng)的879個(gè)DEGs（867個(gè)上調，12個(gè)下調）。其中一些小麥DEGs（主要是下調的）與生物脅迫途徑相關(guān)，線(xiàn)蟲(chóng)DEGs中幾個(gè)推定的效應基因表達上調，線(xiàn)蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶樣效應基因能抑制本氏煙草中BAX引起的細胞程序性死亡。以上結果表明，在寄生初始接觸階段，線(xiàn)蟲(chóng)的響應比小麥更活躍。寄生蟲(chóng)的響應主要與基因（包括至少一個(gè)抗植物防御效應基因）的上調相關(guān)，而宿主響應主要與某些防御基因下調相關(guān)。

 

 

創(chuàng )新點(diǎn)：

第一個(gè)對小麥和禾谷胞囊線(xiàn)蟲(chóng)互作早期轉錄組響應進(jìn)行系統性描述的研究。

參考文獻：

Chen C, Cui L, Chen Y, et al.?Transcriptional responses of wheat and the cereal cyst nematode Heterodera avenae during their early contact stage[J]. Scientific Reports, 2017, 7:14471.