12月12 【成功案例】云平臺助力蕪菁花芽轉錄組比較分析解析多倍體異常減數分裂過(guò)程
ranscriptome?Analysis?of?Floral?Buds?Deciphered?an?Irregular?Course?of?Meiosis?in?Polyploid?Brassica?rapa?
云平臺助力蕪菁花芽轉錄組比較分析解析多倍體異常減數分裂過(guò)程
雜志：?Frontiers?in?Plant?Science?
影響因子：4.298
PMID:28553302
云平臺助力鄭州大學(xué)的老師們發(fā)表了一篇關(guān)于四倍體與二倍體蕪菁轉錄組比較分析的文章，這是第一個(gè)同時(shí)在細胞和轉錄組水平證明染色體多倍性對減數分裂過(guò)程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數分裂時(shí)花芽轉錄組的一致性和差異性。
研究背景：
多倍體化對于動(dòng)植物進(jìn)化及物種形成具有重要意義。染色體倍性增加在大多數植物中十分常見(jiàn)，約30-80％的被子植物在進(jìn)化過(guò)程中歷經(jīng)這一過(guò)程，種內基因組復制可產(chǎn)生同源多倍體，種間雜交可產(chǎn)生異源多倍體。理解多倍體對植物繁殖的影響對于多倍體育種項目具有重要意義。
本文在細胞和分子水平對同源四倍體、二倍體蕪菁的生殖組織（未成熟的花芽）進(jìn)行了轉錄組比較分析。先進(jìn)行細胞學(xué)分析，發(fā)現結果顯著(zhù)異常后，進(jìn)行RNA測序分析，進(jìn)一步闡明這種細胞學(xué)差異的分子機制。
材料和方法:
材料：溫室中培育蕪菁同源四倍體和二倍體，采集1-1.5mm的花芽。
細胞學(xué)分析：花芽制片觀(guān)察染色體行為。
轉錄組分析：二倍體花芽樣本T1，T2，T3,同源四倍體樣本T4，T5，T6進(jìn)行測序，篩選DEGs，進(jìn)行功能注釋及相關(guān)驗證。
測序平臺：Illumina?HiSeq?2000
分析平臺：BMKCloud，具體分析如下：
測序原始數據去接頭、低質(zhì)量序列后與參考基因組比對（TopHat2），對比對上的序列進(jìn)行轉錄本重構，評估表達水平（Cufflinks）。鑒定DEGs（logFC≥2，FDR<0.01）并與Nr、UniProtKB\Swissprot、KOG、COG、GO、KEGG等數據庫進(jìn)行比對注釋。
研究結果：
1.同源四倍體蕪菁異常的減數分裂過(guò)程
減數分裂過(guò)程中染色體行為分析結果顯示：二倍體中，同源染色體中期配對為二倍體，后期分離（圖1A-D）。四倍體中，在減數分裂中期I形成多倍體和單倍體，在后期I、II發(fā)生不均等分離（圖1E-L）。
圖1?四倍體蕪菁異常染色體行為
統計結果表明與二倍體相比，蕪菁多倍體化后整個(gè)減數分裂過(guò)程發(fā)生了不規則變化。
圖2?四倍體蕪菁減數分裂中異常染色體行為分析
2.測序結果
每個(gè)樣本文庫得到29.07?GB?clean?read，Q30≥88.55%?。同源四倍體、二倍體比對到參考基因組效率分別為74.34%，75.88%。樣本組的表達模式分析共得到40927個(gè)基因，其中有1001個(gè)新基因。
3.DEGs分析
40927個(gè)基因中，4601個(gè)基因是差異表達的（圖3A），2343個(gè)上調，2259個(gè)下調（圖3B），兩組間DEGs占比較少（(11.24%）。隨機挑選DEGs進(jìn)行層次聚類(lèi)，分析表達模式（圖3C），發(fā)現四倍體中K1、K3、K6、K9類(lèi)別下調，K2、K4、K5、K7，K8類(lèi)別顯著(zhù)上調。
圖3?DEGs表達分析
與COG、GO、KOG、Nr、KEGG、Swiss-Prot比對后，97%的DEGs至少能與一個(gè)數據庫比對上（表1）
表1?差異表達Unigene注釋
COG分類(lèi)中，2615個(gè)DEGs可歸到25個(gè)COG類(lèi)別（圖4），其中包含最多DEGs的類(lèi)別為：復制重組與修復（222個(gè),8.49%），轉錄（261個(gè),9.98%），一般功能（515個(gè),19.69%)，與KEGG結果一致。
GO分類(lèi)中大多數DEGs聚類(lèi)到細胞過(guò)程（61.97％），繁殖過(guò)程（15.49％），結合過(guò)程（42.96％）（圖5）。
KEGG功能注釋結果表明，4,601個(gè)DEGs中有1,453個(gè)可歸到50個(gè)生物途徑。高度富集的通路為：氨基酸合成（48個(gè)，3.3％），植物激素信號轉導（61個(gè)，4.2％）和蛋白質(zhì)加工內質(zhì)網(wǎng)途徑（47個(gè)，3.2％）（圖6）。
圖4?COG分類(lèi)
圖5?新DEGs的GO分類(lèi)
圖6?KEGG富集通路
4.減數分裂相關(guān)DEGs分析
為闡述四倍體蕪菁減數分裂過(guò)程改變相關(guān)的遺傳信息，選擇以下明顯與減數分裂相關(guān)的COG類(lèi)別進(jìn)行細分：（1）復制，重組和修復;（2）染色質(zhì)結構和動(dòng)力學(xué);（3）細胞周期控制，細胞分裂，染色體分區;（4）細胞骨架。在4,601個(gè)位點(diǎn)中，共鑒定出288個(gè)與減數分裂相關(guān)的基因（圖7A）。
應用擬南芥數據庫（TAIR）的BLASTN搜索，進(jìn)一步鑒定蕪菁中減數分裂直系同源基因，11個(gè)兩組間差異表達的已知減數分裂基因。如圖7所示，顯著(zhù)富集的L組（復制，重組和修復）包含121個(gè)上調、102個(gè)下調基因，這組聚類(lèi)結果（圖8B）顯示已知減數分裂基因（包括RAD54，DMC1和RPA）在四倍體蕪菁中表達顯著(zhù)下調。D組（細胞周期控制，細胞分裂和染色體分配）中，10個(gè)下調，13個(gè)上調，已知的減數分裂基因DIF1/SYN1和CyclinA1-2/TAM上調（圖7C）。在B組（染色質(zhì)結構和動(dòng)態(tài)變化）（圖7D），有7個(gè)基因上調，包括已知調節開(kāi)花時(shí)間和植物發(fā)育的NF-YB8基因，14個(gè)基因下調，包括組蛋白相關(guān)基因（H2AV和H4）。Z組（細胞骨架）中，8個(gè)基因上調，7個(gè)基因下調（圖7E），且沒(méi)有已知減數分裂相關(guān)基因。已知減數分裂基因MMD1和HOP2在一般功能組（R）中富集（圖4）。HOP2，XRI1，ZYP1a和ZYP1b未歸到任何COG組。
KEGG比對后將288個(gè)中的108個(gè)DEGs分配到28個(gè)途徑，包括減數分裂相關(guān)同源重組（2.8％），DNA修復和重組（6.5％），DNA復制（3.7％），染色體和相關(guān)蛋白（4.6％）。
圖7?COG分類(lèi)中減數分裂相關(guān)基因分布及表達分析
同源重組對于真核生物減數分裂中SPO11蛋白質(zhì)引起的DSBs的精確修復十分重要，作為調節關(guān)鍵介質(zhì)的DMC1，RAD54和RPA在這個(gè)途徑中顯著(zhù)下調。Cyclin-A1-2?/?TAM是DNA復制途徑中唯一與細胞周期蛋白有關(guān)的基因，表達上調。這些結果表明染色體集在同源四倍體中增加了一倍，與減數分裂有關(guān)的大多數基因可能通過(guò)上調或至少正常表達以滿(mǎn)足減數分裂期間基因組含量增加的需求。否則，減數分裂關(guān)鍵基因下調可能會(huì )干擾四倍體減數分裂中染色體行為。
qRT-PCR?對24個(gè)減數分裂相關(guān)基因進(jìn)行驗證，20多個(gè)基因表達與測序結果一致。對擬南芥中直系同源基因分析結果顯示兩個(gè)物種減數分裂相關(guān)基因的總體表達模式相近。
結果：
本研究細胞學(xué)分析發(fā)現，合成多倍體整體減數分裂過(guò)程是顯著(zhù)不規則的。為從分子水平闡明這一過(guò)程的遺傳基礎，本文進(jìn)行了同源四倍體和二倍體蕪菁花芽間的遺傳調節差異的轉錄組比較分析。在40927個(gè)表達基因中，同源四倍體蕪菁花芽中鑒定出4601個(gè)DEGs，其中288個(gè)與減數分裂相關(guān)。DMC1（已知減數分裂特異性基因，與DSBs同源染色體依賴(lài)性修復相關(guān)）在同源四倍體蕪菁中表達顯著(zhù)下調，可能與減數分裂I期的異常有關(guān)。某些RNA解旋酶，細胞周期、體細胞DNA修復相關(guān)的DEG在基因組復制后表達上調，減數分裂DSB修復有關(guān)基因表達顯著(zhù)下調。蕪菁和擬南芥中減數分裂相關(guān)基因的總體表達模式相近。
創(chuàng )新點(diǎn)：
這是第一個(gè)在細胞和轉錄組水平證明染色體多倍性對減數分裂過(guò)程有不利影響的研究，有助于全面了解二倍體和多倍體蕪菁減數分裂時(shí)花芽轉錄組的一致性和差異性。
參考文獻：Braynen?J,?Yang?Y,?Wei?F,?et?al.?Transcriptome?Analysis?of?Floral?Buds?Deciphered?an?Irregular?Course?of?Meiosis?in?Polyploid?Brassica?rapa[J].?Frontiers?in?Plant?Science,?2017,?8:768.